摘要：通过对二倍体和三倍体虹鳟红细胞大小的测量，发现两者之间存在着极其显著的差异。三倍体虹鳟红细胞长径和核长径分别是二倍体的1.34和1.33倍；红细胞面积和核面积分别为二倍体的1.43和1.41倍；核体积为二倍体的1.47倍。用MEK-6318血液自动分析仪检测二倍体和三倍体虹鳟血常规值，结果显示：在红细胞计数（RBC）和红细胞平均容量（MCV）上，二、三倍体之间都有着极其显著的差异。此外，三倍体虹鳟的淋巴细胞、中间细胞和中性粒细胞数量都显著超过了二倍体。
虹鳟（Oncorhynchus mykiss）属鲑形目（Salmonlformes）、鲑科（Salmonoidei）、大麻哈鱼属（Oncorhynchus），是我国引进的一种常见的冷水性养殖鱼类[1]。近年来，由于种质的退化，水霉病的发病率居高不下。三倍体育种为解决养殖用虹鳟的品质问题提供了一条切实可行的途径。三倍体由于可育性差，在生殖季节由于性腺发育的能量可用于肉质生长，三倍体育种在鲤鲫杂交及虹鳟、团头鲂、罗非鱼、牡蛎等水产动物的繁养殖中得到广泛的应用[2-6]。
三倍体鱼类在生长和抗病能力上表现出了特殊的优势。三倍体湘云鲫是由异源四倍体鲤鲫与二倍体的日本白鲫杂交得到的，具有生长快和不育的特点，受到生产者和消费者的青睐，经济效益和社会效益十分显著[7]。从斑点叉尾鮰的生长速度和性腺发育状况来看，三倍体的生长速度较二倍体快，雌性性腺发育缓滞。三倍体虹鳟在幼鱼阶段时生长速度稍慢，但性成熟后生长速度超过了二倍体；同时三倍体虹鳟对水霉病和IHN病抵抗力强，且肉质优于二倍体虹鳟[8-10]。
鱼类三倍体鉴别方法主要有红细胞大小测量、染色体计数、DNA含量测定等。测量红细胞大小能快速直观地界定不同倍性的鱼类个体，同时对鱼的存活影响不是很大，是检测不同倍性鱼类的常用方法[10，11]。
根据北京卧佛山庄养殖有限公司近几年的养殖经验，虹鳟三倍体抗病力强、生长快、肉质好，深受消费者的欢迎。本文通过测量红细胞的大小来鉴别二倍体和三倍体虹鳟。应用血液自动分析仪测定血常规，进行二倍体和三倍体虹鳟的血液性状的比较，为虹鳟三倍体的育种与养殖提供依据。
1材料和方法
1.1材料
试验鱼于2006年9月采自北京卧佛山庄养殖有限公司的虹鳟养殖场。其中二倍体虹鳟是1996年从美国引进的，人工繁殖的3～4代幼鱼，三倍体虹鳟是2005年12月从美国北欧玛养殖科技有限公司购入的发眼卵，人工孵化的幼鱼。试验鱼的尾数、体长和体重见表1。
1.2血涂片的制备以及红细胞大小的测量
尾柄部取血，制成血液涂片，经甲醇固定后，Giemsa染色15min，在Olympus显微镜15×100油镜下观察，测量红细胞及核的长径、短径，每尾鱼测定10个红血细胞。以a·b·π/4计算红细胞的面积以及核的面积，以a2·b/1.91计算红细胞核的体积，其中a为短径，b为长径[11]。求出每个个体红细胞的平均值和标准差，并进行二、三倍体之间的t-检验。
1.3血液常规参数的测定
分别取二倍体和三倍体虹鳟各8尾，尾柄部取血约1ml装入用EDTA浸润过的1.5ml离心管中，放入装有冰水的保温盒内，在北京实验动物中心用MEK-6138全自动血液分析仪对样品的11个血液学项目进行测定，依据血液中粒子体积大小设置红细胞和白细胞的灵敏度均为2，通过做梯度曲线来确定其阈值，红细胞和白细胞阈值分别设为5和8。测得的结果除血红蛋白之外相对稳定，其中红细胞平均容量（MCV）超出了仪器的测定范围，所以按 “MCV(10-15L)= 10·HCT(%) /RBC(10-15L）”计算得到。对测得的结果进行t-检验。
2结果
2.1二倍体与三倍体虹鳟的红细胞大小测量
二倍体与三倍体虹鳟的红细胞及核的大小及二者之间的差异显著性检验结果见表2。
由表2可以看出，三倍体虹鳟各项数值都高于二倍体，二者之间表现出极显著差异。二倍体与三倍体的长径之比为1：1.34，其中二倍体个体的红细胞长径范围在14.6～15.3μm之间，而三倍体个体的红细胞长径范围在19.2～20.3μm之间，可以作为判别二倍体和三倍体虹鳟的方法。三倍体虹鳟红细胞核长径、红细胞面积、核面积以及核体积分别为二倍体的1.34、1.43、1.41与1.47倍，差异极显著（P﹤0.001）。在三倍体的血涂片中有一些红细胞核有中间断开的现象（图1），在测量的时候，没有选取此类细胞。
2.2二倍体与三倍体虹鳟的血液常规测定
表3显示了二倍体和三倍体虹鳟血液常规测定项目的平均值、标准差以及二者之间的差异显著性检验结果。
由表3可以看出，三倍体虹鳟的RBC明显低于二倍体，而MCV显著高于二倍体，均呈极显著差异；二倍体虹鳟红细胞比积（HCT）显著高于三倍体，而红细胞体积分布宽度（RDW）两者之间的差异不明显。
依据血液白细胞三分类法，血液白细胞可分为淋巴细胞、中间细胞（包括幼稚细胞、噬酸粒细胞、嗜碱粒细胞、大淋巴细胞和单核细胞）和中性粒细胞[12]。虹鳟三倍体的淋巴细胞、中间细胞和中性粒细胞的绝对值都显著高于二倍体，两者之间的各绝对值及其百分比均呈显著差异或极显著差异。
3讨论
对于二倍体虹鳟血液性状的测定，张桂兰[13]用常规血涂片方法对野生与池养1龄和2龄虹鳟血液红细胞对比发现：野生、1龄、2龄红细胞长径分别为15.1μm、 15.0μm、14.5μm，和本实验测得的1.49μm相近；红细胞数分别为1.02×1012/L、0.98×1012/L、0.98×1012/L，接近本实验测定值1.1×1012/L。钱续[14]等用全自动细胞分析仪对靬金鳟（是甘肃在上世纪90年代初从虹鳟的变异种中选育而成的新品系[15]）的血液进行分析，结果显示：靬金鳟的红细胞总数为0.3×1012/L，显著地低于野生虹鳟及本研究得到的二倍体虹鳟；靬金鳟的白细胞总数为69.3×109/L，显著地高于文中提到的虹鳟，也高于本研究的二倍体虹鳟的结果。钱续[14] 等认为这种白细胞总数增高的现象对于生长在我国西部的靬金鳟的抗病能力是有利的。
对于鱼类二倍体和三倍体的血液性状的比较，红细胞大小因倍性不同而变化。Benfey等[16]对陆封型大西洋鲑二倍体和三倍体的血液学指标进行比较发现：三倍体大西洋鲑细胞长径和核长径分别为：18.3μm和8.4μm，分别为二倍体的1.24和1.26倍，三倍体平均红细胞面积为二倍体的1.36倍，略低于本实验测得的结果（1.43倍），而红细胞核体积为二倍体的1.56倍，比本实验测得的1.48倍略高。红细胞数也会随着倍性的不同而变化。Benfey等[17]也对二倍体和三倍体虹鳟及美洲红点鲑对受迫反应的血液学变化作了对比，未受迫的二倍体和三倍体虹鳟的红细胞数分别为1.24×1012/L和0.73×1012/L，倍间差异显著。二倍体和三倍体美洲红点鲑的红细胞数分别为0.95×1012/L和0.68×1012/L，低于虹鳟对应值，倍间也存在显著差异。本实验测得的二倍体和三倍体的红细胞数分别是1.1×1012/L和0.7×1012/L，接近上述虹鳟测定结果，但高于美洲红点鲑的对应值。
三倍体大西洋鲑红细胞平均容量明显高于二倍体（主要是由于红细胞长径的增加造成的，而短径对其影响很小），而红细胞数显著低于二倍体，使得二者在平均血细胞血红蛋白浓度上保持一致，以维持两类鱼器官大小和形态基本保持不变[10]。
虹鳟白细胞中的中性粒细胞和淋巴细胞占有相当的比例。白细胞的主要作用是保护机体，抵御病害的侵袭，在机体的免疫反应中起主要作用[18]。白细胞数量的差别可用于解释鱼类的抗病和在特定环境下的耐受能力。三倍体虹鳟白细胞中各项值都显著高于二倍体，可能与三倍体抗病能力强有关。
鲤科鱼类随倍性不同，在红细胞特性上也会表现出相似的规律。陶炳春等[19]对鲤鱼二倍体和三倍体的红细胞进行分析，三倍体鲤鱼红细胞的长径和核长径分别是二倍体的1.31和1.30倍，红细胞面积和核面积分别是二倍体的1.54和1.43倍，而红细胞核体积是二倍体的1.57倍。刘巧[2]等对鲤鲫及其杂交后代不同倍性的鱼类的血液学指标进行了对比，得到二倍体、三倍体和四倍体红细胞数目随倍性的升高而降低，红细胞的体积大小呈现2：3：4的关系。邹曙明[4]等对团头鲂血液学研究发现，随着倍性的增加，红细胞大小相关的各数值均显著增大（P<0.05）；其中，核体积增大最为显著，团头鲂同源四倍体、倍间三倍体的核体积分别为二倍体的1.97倍和1.39倍。本实验中三倍体虹鳟的红细胞面积、核面积与核体积都与二倍体存在显著差异，但以红细胞核体积的增加最为明显，是二倍体的1.48倍。也基本上符合三倍体与二倍体鱼类细胞核体积比为3：2的理论比例关系。
参考文献
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