水产百科

二、组织结构中的蛋白酶

2023-02-19

(一) 组织蛋白酶概述及分类

组织蛋白酶是在各种动物组织的细胞内 (特别是溶酶体部分) 发现的一 类蛋白酶。来源于同一种类组织细胞的也是由组织蛋白酶A、组织蛋白酶B、 组织蛋白酶C、组织蛋白酶D、组织蛋白酶E等多种酶组成。可以根据所作用 的代表性底物的种类进行分类,但似乎各自还有数种同工酶。组织蛋白酶A 的代表性底物是N-苄氧基羰基-L-谷酰胺-L -苯丙氨酸,最适pH5.5 (3.0~6.0),可能是一种羧肽酶,可使二异丙基磷氟酸 (DFP) 或对氯汞苯甲 酸 (PCMB) 失活。组织蛋白酶B催化苯甲酰-L-精氨酰胺的水解。其活性 的表现需要巯基化合物 (SH化合物) 的存在,最适pH在6.0附近,有人认 为是类似木瓜蛋白酶的肽链内切酶,已知有B1和B2 (或B′和B) 两种。组织 蛋白酶C的代表性底物是甘氨酰-L-苯丙酰胺,在pH5.0附近催化此酰胺键 的水解,在pH7.0附近时催化以其他底物分子的氨基代替水分子作为受体的 转移反应,又称二肽氨肽酶I (由第一个反应命名) 或二肽转移酶 (按第二个 反应命名)。能被巯基化合物或Cl离子激活。组织蛋白酶D和组织蛋白酶E 可以使用ES010 (MCA-Lys-Pro-Leu-Gly-Leu-DPA-Ala-Arg-NH2) 或ES001 (MCA-Pro-Leu-Gly-Leu-DPA-Ala-Arg-NH2) 作为底物。 两者在pH2.5~4.0具有消化酸变性的血红蛋白或血清白蛋白的肽链内切酶的 作用。巯基化合物对活力没有影响,DFP也不受抑制。

自从20世纪20年代提出组织蛋白酶的概念以来,人们首先于20世纪40 年代发现了组织蛋白酶C,在其后约40年的时间中有关该酶的研究进展缓慢, 到20世纪70年代初组织蛋白酶B、组织蛋白酶H、组织蛋白酶L陆续被鉴定 并测序,直至20世纪90年代测定了组织蛋白酶B的晶体结构后,有关组织蛋 白酶的研究进展迅速,越来越多的组织蛋白酶被发现,到目前为止从组织蛋白 酶A到组织蛋白酶Z都已有报道。根据各白水解机制及催化中心的不同,组 织蛋白酶可分成不同的类型。组织蛋白酶成员大部分 (B、C、K、L、M、N 和S等) 属于半胱氨酸蛋白酶,少数为天冬氨酸蛋白酶(组织蛋白酶D、组织 蛋白酶E) 和丝氨酸蛋白酶 (组织蛋白酶A、组织蛋白酶G和组织蛋白酶R)。

(二) 组织蛋白酶的结构

组织蛋白酶都是由体内先合成的无活性的前体酶原 (preprocathepsin) 水 解而成的,其在体内的合成途径为: 首先在体内核糖体上以前体酶原的形式合 成,经转铁蛋白进入内质网,然后再进入高尔基体,同时通过糖基化及磷酸化 作用形成甘露糖-6-磷酸蛋白,最后通过溶酶体上甘露糖-6-磷酸特异性受 体的识别作用,间接转运到溶酶体中。组织蛋白酶的前体酶原由信号肽 (signal-peptide)、前体肽 (propetide) 和含有催化活性中心的成熟肽 (maturepeptide) 构成。信号肽的长度在10~20个氨基酸残基之间,它负责将核糖体 表达的前体酶原蛋白转运至内质网,在内质网被水解掉后形成只含前体肽和成 熟肽的酶原 (procathepsin)。前体肽氨基酸残基数差别较大 (在36~315之 间),它占据了酶的活性中心,使酶原没有催化活性,并随之转运入胞内溶酶 体,在溶酶体的酸性条件下自动水解,去掉前体肽,产生有活性的成熟的组织 蛋白酶。所以前体肽又是能阻止酶原活力的高亲和性可逆抑制剂。成熟肽长度 在210~260个氨基酸残基之间,它具有高度的保守性。

组织蛋白酶在氨基酸序列上存在保守性,都具有由Cys25、His159和 Asn175残基 (木瓜蛋白酶编号) 组成的保守活力位点,其他的一些氨基酸序 列区域也表现出一定程度的保守性,其中包括形成二硫键的多个半胱氨酸残 基,组织蛋白酶通常都由二硫键连接的轻链和重链两条多肽链组成。在空间结 构上组织蛋白酶也表现出高度保守性,成熟的组织蛋白酶除了组织蛋白酶C为 分子质量约为200ku的低聚体外,其余的为分子质量20~35ku的单体,它们 都包括几乎同样大小的两个结构域L域和R域。L域包含3个α-螺旋区,其 中最长的一个α螺旋 (中心螺旋) 由约40个氨基酸残基组成,其N末端含有 保守位点Cys25。R域为主要由5~6条β-链形成的桶状结构,其中含有保守 位点His159、Asn175。在大部分酶的L域中至少形成了两个二硫键,从而增加 了该结构域的稳定性,而在R域中只发现了一个二硫键。由于L域和R域的 存在,使得该酶结构上形成明显分界,它们之间也因此形成了一个 “V” 形的 活力位点沟槽,L结构域中的Cys25和R结构域中的His159、Asn175活力残 基就位于该 “V” 形沟槽中。在中性或弱酸性的环境中,His159残基中的咪唑 基能使Cys25残基中的巯基极化而使其失去质子,形成Cys25-S-/H151- ImH+离子对,而Asn175则通过形成氢键使该离子对趋于稳定。由于Cys25- S负离子具有很强的亲核能力,能进攻其底物肽的羰基碳,通过脱酞基作用 使得含羰基的基团离去,从而发挥其蛋白水解作用。

(三) 鱼虾贝的组织蛋白酶

鱼虾贝死亡后肌肉变得对内源性肌肉蛋白酶非常敏感,导致组织结构软 化。肌肉蛋白酶活力在温度高于50℃时很高,引起肌原纤维,特别是肌球蛋 白迅速而严重的降解。在鱼虾贝肌肉中存在的蛋白酶的种类因鱼虾贝种类而有 差异,但组织蛋白酶和热稳定碱性蛋白酶是最有活力的两种。海洋水产生物细 胞的溶酶体中富含多种组织蛋白酶,一些鱼虾贝类组织蛋白酶含量是哺乳动物 组织蛋白酶含量的十几倍甚至于几十倍,这些组织蛋白酶作用的最适pH环境 一般为酸性环境。在鱼虾贝机体中,组织蛋白酶的分布是不均匀的,肝脏、肾 脏和脾脏富含组织蛋白酶,而皮肤、鳃和心肌组织的含量很少。

通过太平洋牙鳍 (pacific whiting) 和剑齿比目鱼 (arrowtooth flouder) 研 究表明,在半胱氨酸蛋白酶中主要是组织蛋白酶L、组织蛋白酶B和组织蛋白 酶H起作用,这类酶在50~60℃具有最大的蛋白质自溶作用。将太平洋牙鳍 在60℃放置30min,再在90℃下煮制,会使大多数的肌球蛋白重链发生降解。 在太平洋牙鳍鱼糜中,97%的蛋白酶活力属于半胱氨酸蛋白酶的活力,而组织 蛋白酶在鱼肉中最有活力。在鱼体中的组织蛋白酶有L、组织蛋白酶B和组织 蛋白酶H三种,它们对蛋白质的作用各有不同。组织蛋白酶L被称为真正的 内肽酶 (endopeptidase),组织蛋白酶既有具有内肽酶的作用,也具有外肽酶 (exopeptidase) 的作用,组织蛋白酶B为内胺肽酶 (en-doaminopeptidase)。组 织蛋白酶B是溶酶体内半胱氨酸蛋白水解酶,其催化作用由Cys和His实现,易 被巯基试剂抑制,又称巯基酶,属于木瓜蛋白酶家族。在pH3.0~7.0都具有活 力,碱性条件下会不可逆失活。其前体蛋白分子质量为40~45ku,成熟蛋白 分子质量为27~36ku,常有单链或双链形式。在鱼肉中的蛋白酶活力主要由 肌肉组织蛋白酶L决定,组织蛋白酶L对肌球蛋白具有很高的亲和力,而组织 蛋白酶H和组织蛋白酶B的亲和力则较差。来源于太平洋牙鳍的组织蛋白酶L 由一条肽链组成,最适作用温度为55℃,最适pH为5.25~5.50。

鲭鱼白肉自溶过程中放出水解酶,其中的组织蛋白酶B、组织蛋白酶L、 组织蛋白酶D、P-N-乙酰基糖苷酶以及碱性磷酸酶的活力比较高,组织蛋 白酶L对肌浆球蛋白、肌钙蛋白T和I、原肌球蛋白和肌动蛋白溶液中的原肌 球蛋白有降解作用; 组织蛋白酶B对肌原纤维没有降解作用。鲭鱼的白肉死后 发生降解,主要是由于溶酶体中组织蛋白酶L的作用。太平洋鳍鱼片的所有组 织蛋白酶中以组织蛋白酶B的活力最高,而鱼糜中组织蛋白酶L的活力占主 导地位。当温度为55℃时,组织蛋白酶L在鱼片和鱼糜中表现出最高活力。 这表明当对鱼片和鱼糜进行加热时,组织蛋白酶L对肌浆球蛋白起降解作用, 鱼糜加工清洗时洗掉了组织蛋白酶B和组织蛋白酶H而不能洗掉组织蛋白 酶L。