水产百科

三、鲍病毒性死亡病检疫操作

2023-02-18

鲍病毒性死亡病,又称为鲍病毒病,2008年 《中华人民共和国农业部公告第1125号》将其列为三类动物疫病,是严重影响我国南北方鲍鱼养殖业的一种疾病。病原为鲍球状病毒 (Abalone spherical viruse)。该病主要发生在每年的春、冬季低温季节,随着水温的升高病情趋缓,水温高于24℃时基本不发病,该病潜伏期短、发病急、传播快、死亡率高,4~30 d死亡率95%以上。 (一)临床检查 1. 群体检查 主要检查待检批次鲍苗种的活力、外观、生长状况、运动或附着状态、摄食情况、排泄物状态及抽样存活率等是否正常。若群体活力旺盛,自然生活时呼吸、滤水或爬行正常,受刺激时逃避、收腹足等反应迅速,腹足吸附牢固,个体大小及质量均匀,壳纹轮线规则,不存在非正常死亡、空壳或濒死个体,通过随机抽样进行个体检查和试剂盒检查。 群体中若有活力差、腹足附着不牢固、外观有缺损、体型明显偏小、质量明显偏轻的个体,优先选择其进行个体检查和试剂盒检查。 2. 个体检查 (1)外观检查。主要观察鲍个体附着强度、腹足是否萎缩及颜色变化、贝壳边缘是否翻卷、是否有大量黏液分泌等。若待检批次鲍苗种出现鲍附着力及移动性减弱,腹足萎缩、形成瘤状物、发黑并变硬,贝壳变薄、边缘翻卷,大量分泌黏液等情况,怀疑患鲍病毒性死亡病。 (2)解剖检查。按照 “第三章 解剖操作 三、贝类解剖”部分解剖鲍,暴露内脏器官后,观察外套膜是否发黑、卷曲、萎缩,肝胰腺及肠道是否肿大等情况。若待检批次鲍苗种外套膜萎缩,出现赤褐色化缺损,肝和肠道肿大,怀疑患鲍病毒性死亡病。 3. 快速检测试剂盒检测 按照病原快速检测试剂盒说明书进行采样和现场快速检测,样品出现试剂盒所指示的阳性反应,怀疑存在鲍病毒性死亡病病原。 (二)实验室检查 对怀疑患有鲍病毒性死亡病及临床检查发现具有鲍病毒性死亡病相关临床症状的苗种,应按 《水生动物产地检疫采样技术规范》(SC/T 7103—2008) 的要求对该批次苗种采集样本进行实验室检测。下面介绍鲍病毒性死亡病的一种球状病毒检测方法。 1. 采样 按SC/T 7103—2008的规定执行。 2. 样品处理 小心剪去外套膜暴露其内脏组织,然后剪取肝胰腺、鳃、外套膜、肌肉等组织50~100 mg,置于1.5 mL灭菌的微型离心管中 (图10-3、图10-4)。

图10-3 剪取组织样品

图10-4 置于灭菌的微型离心管中

3. DNA提取 参照 “第九章 甲壳类主要疫病的检疫操作技术 一、对虾白斑综合征检疫操作”部分DNA提取方法进行。 4. 对照的设立 (1)在样品处理过程中应设立阳性对照、阴性对照以及空白对照。 (2)取已知携带鲍球状病毒的鲍组织样品作为阳性对照。 (3)取正常的未携带该病毒的鲍组织作为阴性对照。 (4)取等体积的水代替模板作为空白对照。 5. 巢式PCR法检测 具体操作方法参照 “第六章 PCR基本操作”部分。 (1) PCR反应管中依次加入: DNA模板100 ng; PCR预混液包括buffer (含Mg2+),dNTP,Taq DNA聚合酶10 μL;引物500 nmol/L,总体积为20 μL,混匀,离心片刻。 (2)将PCR管置于PCR扩增仪上,设置好反应程序: 95℃ 5 min (预变性),94℃ 40 s (变性),60℃ 40 s (退火),72℃ 40 s (延伸),30个循环; 72℃ 7 min (延伸)。先使用外引物P1/P2进行第一次扩增,再将第一次扩增产物作为模板,使用内引物P3/P4进行巢式PCR扩增。 P1: 5′-ATG ACA GAT TTC ACC GTA AGC AAT GAA AAT C-3′, P2: 5′-CTA GCT GGC TTT GGT ATA AGT AGT ACC AAA AG-3′; P3: 5′-GCA ACA TTC CAG TTA GCC-3′, P4: 5′-CCG TAG TAG CAG CAA-3′。 (3) 反应结束,关闭PCR扩增仪,从PCR扩增仪中取出扩增产物,放置于4℃待电泳检测。 6. PCR产物的电泳检测 具体操作方法参照 “第六章 PCR基本操作”部分。 在紫外灯下观察: 阳性样品可见特异的DNA带,阴性和空白样品无特异的DNA带。 7. 结果判定 (1)样品第一次PCR扩增后出现528 bp的DNA带,或二次PCR扩增后出现163 bp的DNA带,判定该批次鲍苗种感染鲍病毒性死亡病病毒或携带鲍病毒性死亡病病毒。 (2) 样品PCR扩增后没有出现528 bp或者163 bp的DNA带,判定该批次鲍苗种未感染鲍病毒性死亡病毒病或不携带鲍病毒性死亡病病毒。