桃拉综合征，俗称 “红尾病”，是由桃拉综合征病毒 (Taura syndrome virus，TSV) 引起的一种严重传染性对虾疾病，急性期以虾体变红、软壳，过渡期以角质上皮不规则黑化为特征。此病毒主要分布在美洲和东南亚地区，主要宿主为凡纳滨对虾和细角对虾。对虾科滨对虾属所有成员均对此病毒易感，其中凡纳滨对虾从仔虾、幼虾到成虾各期均易感病，但14～40日龄、体重0.05～5 g的仔虾最易感染，对虾科其他成员也可感染，但一般不表现临床症状。该病发病急、死亡率高，累积死亡率80%～90%，发病存活率一般不超过20%。 (一)临床检查 1. 群体检查 主要检查待检批次对虾群体的游动状态、摄食情况是否正常。若对虾群体活力旺盛，逃避或反抗反应明显，体色一致，外观正常，个体大小较均匀，摄食正常，则随机抽取不少于150尾进行个体检查和试剂盒检查。 群体中若有活力差、逃避反应弱，体色发红、发白，外观缺损、畸小，离群、厌食的个体，在排除处于蜕壳状态的情况下，选择具有上述临床症状明显的个体不少于10尾进行个体检查和试剂盒检查。 2. 个体检查 主要检查体色及体表光滑及完整情况，附肢有无坏死，有无黑斑、红体情况，附肢、尾扇是否发红。若对虾出现体表淡红，尾扇和游泳足呈明显的红色，游泳足或尾足边缘上皮呈灶性坏死，甲壳下上皮出现多处随机、不规则的、黑色沉着性病灶 (图9-17、图9-18)，怀疑患对虾桃拉综合征。 3. 快速检测试剂盒检测 按照病原快速检测试剂盒说明书进行采样和现场快速检测，样品出现试剂盒所指示的阳性反应，怀疑存在对虾桃拉综合征病原。
图9-17 感染TSV中期(胡超群供)
图9-18 感染TSV后期(胡超群供)
(二)实验室检查 对怀疑患有对虾桃拉综合征及临床检查发现具有桃拉综合征相关临床症状的苗种，应按 《水生动物产地检疫采样技术规范》(SC/T 7103—2008)的要求对该批次苗种采集样本进行实验室检测。 桃拉综合征实验室检测一般采用PCR方法进行检测，检测标准按农业部相关规定。以下介绍PCR的一般操作方法。 1. 试剂和材料 (1)水： 应符合GB/T 6682—1992中一级水的要求。 (2) Trizol： 4℃保存。 (3) Taq酶： 5U/μL，-20℃保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。 (4)逆转录酶AMV： -20℃保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。 (5) RNA酶抑制剂 (RNasin)： -20℃保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。 (6) dNTP： 含dCTP、dGTP、dATP、dTTP各10 mmol/L。 (7)无水乙醇： 分析纯。 (8) MgCl2溶液： 25 mmol/L (9) Taq酶用10×浓缩缓冲液 (10×buffer)。 (10)逆转录酶用5×浓缩缓冲液。 (11)异丙醇： 分析纯，使用前预冷到-20℃。 (12) 引物： 浓度为40 μmol/L，其序列分别为TSVF： 5′-TCA ATG AGAGCT TGG TCC-3′，TSVR： 5′-AAG TAG ACA GCC GCG CTT-3′，扩增231 bp的片段。 (13)上样缓冲液： 每100 mL溶液中含溴酚蓝0.25 g，蔗糖40 g。 2. 采样 按SC/T 7103—2008的规定执行。 3. 样品处理 受精卵、3 cm以下幼虾、仔虾、幼体 (剪掉眼柄)采集整条对虾作为样品，成虾采集上皮、肝胰腺、肠或鳃作为样品。取样品5～100 mg置于1.5 mL灭菌的离心管中。 4. RNA提取 (1)在离心管中加入0.5～1 mL Trizol试剂 (图9-19)，用研磨棒研磨 (图9-20)，然后室温静置5 min。
图9-19 加入Trizol试剂
图9-20 研磨棒研磨
(2)在含有样品的离心管中加入200 μL氯仿抽提液，上下颠倒混匀 (图9-21)，室温静置3 min。 (3) 4℃，10 000 r/min离心5 min，小心吸取上层水相，移至一支无RNA酶的2 mL离心管中 (图9-22)。
图9-21 上下颠倒混匀
图9-22 离心后分层
(4)加入500 μL异丙醇中，混匀，室温静置10 min。 (5) 4℃，10 000 r/min离心10 min，倒去上清液 (图9-23)。 (6)加入1 mL无RNA酶的70%乙醇，振摇1 min (图9-24)，洗涤2次，4℃，10 000 r/min离心3 min，倒去上清液。
图9-23 离心后倒去上清液
图9-24 振摇混匀
(7) 敞口颠倒离心管，于室温晾干沉淀。 (8) 加20～100μL DEPC水溶解RNA沉淀 (若不能完全溶解可于55～60℃放置10 min)，立即用作逆转录模板或于-20℃保存。 5. 逆转录反应 (1)变性和退火。在PCR管中加入10 μL模板和2.5 μL引物R1，加2.5 μL水使总体积为15 μL。置于70℃反应5 min，立即冰浴至少1 min，低速离心约5 s，将液体收集在底部。 (2) cDNA合成。在上述反应管中继续加入： 5×buffer (Promega) 5μL dNTP 2μL DEPC-H2O 1.5μL RNA酶抑制剂 (20 U) 0.5 U 逆转录酶AMV (10 U) 1μL 总体积为25 μL。42℃ 60 min反应以合成cDNA。 6. PCR扩增 在上述反应管中在继续加入Taq酶5 U、dNTP 1μL、反正向引物各1μL、25 mmol MgCl2 10μL、10×Taq酶浓缩液10μL，加水到总体积100 μL。混匀后低速离心，再将PCR管置于PCR扩增仪。程序： 94℃ 4 min (预变性)，50℃1 min (退火)，72℃ 1 min (延伸); 94℃ 1 min (变性)，50℃ 1 min (退火)，72℃ 1 min (延伸)，35个循环; 72℃ 10 min (延伸); 4℃保温。 经PCR扩增后，阳性对照会出现一条231 bp的DNA带，阴性对照和空白对照没有该核酸带 (图9-25)。 7. 结果判定 (1)样品PCR扩增后出现231 bp的DNA带，判定该批次对虾苗种感染对虾桃拉综合征病毒或携带对虾桃拉综合征病毒。 (2)样品PCR扩增后没有出现231 bp的DNA带，判定该批次对虾苗种未感染对虾桃拉综合征病毒或不携带对虾桃拉综合征病毒。
图9-25 TSV检测结果 M. DL2000 Marker; B. 空白对照; P. 阳性对照; S. 样品： N. 阴性对照