(一) PCR反应程序设置 温度与时间的设置： 在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在Taq DNA聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。 1. 变性温度与时间 变性温度低、解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，93～94℃ 5 min足以使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。 2. 退火(复性)温度与时间 退火温度是影响PCR特异性的重要因素。变性后温度快速冷却至40～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及浓度，还有靶基因序列的长度。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：
Tm值 (解链温度)=4 (G+C)+2 (A+T) 复性温度=Tm值-(5～10℃)
在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。复性时间一般30～60 s，足以使引物与模板之间完全结合。 3. 延伸温度与时间 PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间可根据待扩增片段的长度而定，一般1 kb以内的DNA片段，延伸时间1 min是足够的; 3～4 kb的靶序列需3～4 min; 扩增10 kb需延伸至15 min。延伸时间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。 (二)正确选择凝胶浓度 对于琼脂糖凝胶电泳，浓度通常在0.5%～2%，低浓度的凝胶用来进行大片段核酸的电泳，高浓度的凝胶用来进行小片段分析。低浓度胶易碎，小心操作和使用质量好的琼脂糖是解决办法。注意高浓度的凝胶可能使分子大小相近的DNA带不易分辨，造成条带缺失现象。 制备琼脂糖凝胶可根据DNA分子的范围来决定凝胶的浓度 (表6-1)。
表6-1 琼脂糖浓度与DNA分子的分离范围的关系
| 琼脂糖浓度(%) | 线型DNA分子的分离范围(kb) |
| 0.3 | 5～60 |
| 0.6 | 1～20 |
| 0.7 | 0.8～10 |
| 0.9 | 0.5～7 |
| 1.2 | 0.9～6 |
| 1.5 | 0.2～3 |
| 2.0 | 0.1～2 |
(三)适合的电泳缓冲液 常用的缓冲液有TAE和TBE，TBE比TAE有着更好的缓冲能力。电泳时使用新制的缓冲液可以明显提高电泳效果。注意： 电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，pH上升，缓冲性能下降，可能使DNA电泳产生条带模糊和不规则的DNA带迁移现象，应及时换掉。 (四)电泳的合适电压和温度 电泳时电压不应该超过20 V/cm，电泳温度应该低于30℃，对于大片段的DNA电泳，温度应该低于15℃。注意： 如果电泳时电压和温度过高，可能导致出现条带模糊和不规则的DNA带迁移现象，特别是电压太大可能导致小片段DNA跑出凝胶而出现缺带现象。 (五) DNA的上样 正确的DNA上样量是条带清晰的保证。注意： 太多的DNA上样量可能导致DNA条带模糊，而太少的DNA上样量则导致条带弱，甚至缺失。 (六) Marker的选择 DNA电泳一定要使用DNA Marker或已知大小的阳性对照DNA来估计DNA片段大小。Marker 应该选择在目标片段大小附近条带较密的，这样对目标片段大小的估计才比较准确。