(一)菌落形态观察 将纯培养菌落接种于适宜细菌生长的平板培养基，恒温培养24 h，观察菌落特征 (图5-28、图5-29)： (1)颜色： 黄色、金黄色、灰色、乳白色、红色、粉色等。 (2)干湿程度： 干燥、湿润、黏稠。 (3)形态： 圆形、不规则等。 (4)形状： 扁平、隆起、凹陷等。 (5)透明程度： 透明、半透明、不透明。 (6)边缘： 整齐、不整齐。 (7)培养基的颜色等。
图5-28 菌落形态(引自周德庆，2002) 1. 圆形、边缘整齐、表面光滑; 2. 圆形、边缘整齐、表面有同心圆; 3. 圆形、叶状边缘、表面有放射状褶皱; 4. 圆形、锯齿状边缘、表面较不光滑; 5. 不规则形、波浪边缘、表面有不规则皱纹; 6. 圆形、边缘残缺不全、表面呈颗粒状; 7. 毛状; 8. 根状
图5-29 菌落隆起度(引自周德庆，2002) 1. 扁平状; 2. 低隆起; 3. 隆起; 4. 台状; 5. 脐状; 6. 纽扣状; 7. 乳头状; 8. 褶皱凸面
(二)光镜下细菌形态学观察 对培养16～18 h的幼龄菌进行常规革兰氏染色(金黄色葡萄球菌作阳性对照，大肠杆菌作阴性对照)，具体操作步骤如下： (1)取干净载玻片一块，在其上滴一滴生理盐水，用接种环从平板上挑取一单菌落到水滴中，轻蘸2～3下。将接种环在酒精灯外焰来回烧红3次去除细菌，冷却后用接种环将玻片上水滴涂布均匀 (图5-30、图5-31)。
图5-30 在干净载玻片上滴一滴生理盐水
图5-31 将菌涂布均匀
(2) 让菌涂片自然晾干或在酒精灯上方烤干，温度不超过50℃。 (3)手持载玻片一端，让有菌一面朝上，通过火焰2～3次以固定涂片(图5-32)，温度不超过50℃。 (4)滴加结晶紫染液覆盖菌液涂布区，染色1 min后自上而下小水流冲洗 (图5-33、图5-34)。
图5-32 火焰上方固定涂片
图5-33 菌液涂布区滴加结晶紫染液
图5-34 小水流冲洗染液
(5)滴加碘液媒染1 min，同 (4)步骤冲洗菌涂片;滴加95%乙醇脱色30 s，同 (4)步骤冲洗菌涂片。 (6)滴加番红复染1 min，同 (4)步骤冲洗菌涂片。 (7)染好的涂片自然晾干，盖上盖玻片，于油镜 (油镜的使用方法参照 “附录Ⅰ 实验室常用仪器使用与维护”部分)下观察。金黄色葡萄球菌应呈紫色，大肠杆菌呈红色。若被检菌株革兰氏染色后呈紫色，则革兰氏阳性; 若染色后呈红色，则革兰氏阴性 (图5-35、图5-36)。
图5-35 金黄色葡萄球菌革兰氏染色呈紫色
图5-36 大肠杆菌革兰氏染色呈红色
(三)细菌生理生化特征鉴定 1. 氧化酶 用铂金丝接种环取培养18～24 h的菌落，涂抹在氧化酶试纸上，观察颜色变化。如在10 s菌苔现红色者为阳性，10～60 s现红色者为延迟反应，也记为阳性，60 s以上现红色者或不变色，定为阴性 (图5-37、图5-38)。
图5-37 用铂金丝接种环取菌苔
图5-38 将菌苔涂抹在氧化酶试纸上
2. 接触酶 以灭菌接种环挑取培养18～24 h的菌落，小心涂布于滴有3%过氧化氢的玻片上，如有气泡产生则为阳性，无气泡则为阴性 (图5-39、图5-40)。 3. 运动性试验
图5-39 在玻片上滴加3%过氧化氢
用接种针蘸取菌株垂直穿刺接种于半固体培养基内 (图5-41)，28℃培养24 h后用透射光目测。如生长物只生长在穿刺线上，边缘十分清晰，则表示菌种无运动性; 如生长物由穿刺线向四周呈云雾状扩散，其边缘呈云雾状，则表示菌种有运动性。 4. 其他各项生理生化指标的测定 购买生理生化鉴定管，按照生理生化鉴定管说明书对分离菌株的酶类产生、水解活性、蛋白降解、单一碳源生长及温度耐受等生理生化指标进行测定。
图5-40 将菌落涂布于滴有过氧化氢的位置
图5-41 接种针穿刺接种菌种于半固体培养基内
(四)细菌分子鉴定 聚合酶链式反应 (PolymeraseChain Reaction，PCR) 技术是实验室细菌鉴定的主要方法之一，首先提取细菌总DNA，以此为模板通过16SrRNA通用引物或病原菌特异性引物进行PCR扩增，鉴定病原菌。通用引物PCR扩增产物必须经过扩增、测序和对比才能鉴定细菌，而特异性引物PCR扩增出阳性条带即可确认。下面以16S rRNA通用引物进行PCR鉴定病原菌为例，介绍细菌的分子鉴定操作方法。 1. 细菌DNA的提取 (1)挑取己纯化好的单菌落置于70 μL无菌双蒸水中，用移液器吹打均匀 (图5-42、图5-43)，制成菌悬液。
图5-42 无菌接种环挑取单菌落
图5-43 将单菌落置于无菌双蒸水中
(2) 100℃水浴10 min，立即放入冰上或-20℃冰箱骤冷10 min。革兰氏阴性细菌煮-冻一次即可，而革兰氏阳性细菌要反复煮-冻数次 (图5-44、图5-45)。
图5-44 菌悬液放在煮沸的锅内水浴
图5-45 水浴后立即冰浴
(3) 12 000 r/min离心7 min，收集上清液，作为PCR模板，-20℃保存备用 (图5-46)。 2. 16S rRNA基因序列的PCR扩增 用于16S rRNA扩增的引物为通用引物，由生物技术公司合成，正向引物8F： 5′ -AGA GTT TGA TCCTGG CTC AG-3′(对应于E.coli的第8～27个碱基位置)，反向引物1492R： 5′-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3′(对应于E.coli 16S rRNA的第1 492～1 510个碱基位置)。 (1)在冰浴条件下，将10×PCR缓冲液、dNTP、正反向引物、模板DNA、MgCl2溶液、Taq DNA聚合酶和无菌双蒸水等加入0.2 mL无菌离心管。视PCR仪有无热盖，不加或者添加矿物油密封。 (2)将上述混合液在低速离心机 (500～800 r/min)上离心30 s后，立即置PCR仪上开始扩增 (图5-47、图5-48)。 (3) PCR扩增仪反应程序： 94℃ 4 min (预变性); 94℃ 1 min (变性)，48℃1 min (退火)，72 ℃ 2 min(延伸)，30个循环; 72℃ 10 min (延伸)。 (4)反应结束，关闭PCR扩增仪，取出PCR产物，放置于4℃待电泳检测，或置于-20℃长期保存。
图5-46 离心后收集上清液
图5-47 将反应混合液在低速离心机上离心
图5-48 置于PCR仪上进行扩增
3. PCR产物的电泳检测 取5μL扩增产物与1μL6×上样缓冲液混合，以DL2000 Marker作为对照在浓度为0.8%琼脂糖凝胶中电泳 (40 min，100 V)，紫外灯下观察是否扩增出1.5 kb目标片断 (图5-49)。确定条带后，将PCR扩增产物送交生物技术公司进行纯化和序列测定。 4. 16S rRNA序列分析和系统发育树构建
图5-49 电泳检测结果 M. DL2 000 Marker; 1. 待鉴定菌株
将获得的16S rRNA基因序列提交到GenBank核苷酸序列数据库进行同源序列检索，选取同属标准菌株的基因序列，用DNAstar软件进行多序列对比和系统发育树构建，根据与标准菌株序列同源性的吻合度判定。细菌分类学家普遍认为16S rRNA基因序列之间的同源性大于97.5%的细菌菌株可视为同种。