英文
Studies on Crystal Structure of Insulin
简介
翻开近代生命科学史，人们会发现，作为一种分子量很小的典型蛋白质激素，胰岛素与生物化学领域中的许多重要进展和突破密切相关，这其中也记录了中国科学工作者的可贵贡献，胰岛素晶体结构的测定就是继我国科学家成功地人工合成结晶牛胰岛素之后取得的又一项重要成果，并作为一个重要的学术事件而载入史册。
胰岛素的晶体结构，是指胰岛素分子的空间结构或三维结构，更确切地说，是指用X-射线单晶衍射方法测定的胰岛素分子的三维结构。1960年，Kendrew等测定了第一个蛋白质——肌红蛋白的晶体结构，这一开创性的工作不仅宣告了一个崭新的学科——蛋白质晶体学的开始，也把人们对蛋白质功能的认识和理解带进分子水平的三维结构的新领域。1965年，中国杰出的科学家们用化学方法全合成具有全部生物活力的结晶牛胰岛素获得成功，这是多肽和蛋白质合成研究领域的一个里程碑，它极大地鼓舞了我国年轻的科技工作者并直接引发了我国胰岛素研究向三维结构深入和扩展。1967年，由中国科学院物理研究所、中国科学院生物物理所和北京大学的科技工作者决定通力合作，测定胰岛素的晶体结构。随后，又有中国科学院计算技术研究所、中国科学院上海生物化学所和福建物质结构所的研究人员加入，北京胰岛素结构研究组正式成立，开始用X-射线晶体衍射技术测定三方二锌猪胰岛素的晶体结构。当时正值20世纪60年代末，国际上只有少数几个蛋白质的晶体结构被测定，蛋白质晶体结构测定的方法和技术也正处于实践和完善阶段，中国科学工作者能在当时选择并确定胰岛素三维结构的研究课题，无论对蛋白质三维结构研究，还是胰岛素研究本身，都是一个极富挑战性的前沿课题。经过艰苦努力，首先于1969年获得了4A分辨率的电子密度图，确定了晶胞中胰岛素分子的边界和大部分肽段的走向。随后，将研究的分辨率扩展到2.5A，确定了胰岛素分子的全部肽链走向和大部分残基侧链的正确取向，标志着2.5A分辨率的三方二锌猪胰岛素的晶体结构测定成功。紧接着，结构分析的分辨率被再次扩展到1.8A，并进一步完成了结构的精化。胰岛素分子三维结构的阐明，为胰岛素结构与功能关系研究提供了重要的结构基础。1979年，原参加胰岛素结构测定的部分人员重新组成研究组，以胰岛素结构与功能关系为中心，先后完成1.2高分辨率胰岛素晶体结构的修正、1.5分辨率去五肽胰岛素结构测定与精化以及一系列胰岛素类似物的结构测定。与此同时，由著名晶体学家、诺贝尔奖获得者D.Hodgkin教授领导的牛津小组的胰岛素晶体结构的研究工作几乎与中国小组同步进展，他们首先于1969年报道了2.8分辨率的研究结果， 1971年报道了1.9的研究结果。在此期间，D. Hodgkin教授几次亲自访问北京，对双方各自独立获得的不同阶段的研究结果进行了详细的比较和有益的交流，对中国小组的研究工作给予了充分的肯定和高度评价。
胰岛素是具有多种生物功能的蛋白质激素，除了具有刺激葡萄糖、氨基酸、脂肪和蛋白质的利用，多种酶的激活以及脂肪和蛋白质的合成等代谢效应外，还具有促进DNA和RNA的合成，刺激细胞生长分化的生长效应。这些重要的生物效应是由胰岛素分子特异而精巧的三维结构所决定的。胰岛素是一种只有51个氨基酸的蛋白质。一个胰岛素分子由A、B两条链组成，A链含有21个氨基酸，B链含有30个氨基酸。胰岛素晶体结构(三维结构)的测定就是要确定组成胰岛素分子的51个氨基酸在三维空间的相互位置和关系，也就是要最终确定组成胰岛素分子的全部784个原子(包括403个非氢原子和381个氢原子) 在晶胞中的三维坐标，从而确定胰岛素分子真实而准确的三维结构。
中国的胰岛素晶体结构研究可以分为两个阶段： 即晶体结构测定阶段和三维结构与功能关系研究阶段。现将其主要研究内容和结果分述如下：
1. 胰岛素晶体结构测定 胰岛素晶体结构的测定是采用X-射线单晶衍射结构分析法完成的。该方法的基本原理是： 先将被测的蛋白质(如胰岛素) 培养成一定尺寸的单晶，利用晶体对X-射线的衍射收集全部衍射数据，这些衍射数据的方向和强弱是由组成晶体的蛋白质的分子结构 (组成该分子的全部原子)和分子在晶胞中的排布所决定的。因此，这些衍射数据中应该蕴含着蛋白质分子的结构信息。作为单晶结构分析的另一重要因素是相位问题，因为衍射数据的相位并不能直接用实验手段获得，因此相位问题也是结构测定的核心问题。相位问题是用多对同晶置换法 (MIR) 解决的，即用各种不同重原子试剂浸泡蛋白质晶体，制备一定数目的能使衍射特征发生变化的重原子衍生物，利用这些衍生物晶体与蛋白质母体晶体的衍射强度的差异获得相位信息，再利用结构因子与电子密度之间的数学关系 (Fourier变换) 获得整个晶胞的全部原子的电子密度分布。接下来的工作将包括电子密度的分析与辨认、结构模型的构建与修正、结构特征的分析与讨论等。可以说，蛋白质结构分析的全过程对于当时中国的年轻科技工作者全是未曾接触过的新课题，凭着群策群力，通力合作，终于闯过一个个难关，取得胰岛素晶体结构测定的成功。
胰岛素晶体是用分批静置法培养的，用浸泡法成功地制备了三个胰岛素同晶置换重原子衍生物，即乙基氯汞胰岛素、乙酸铅胰岛素和异丙基氯汞乙酸铅胰岛素。衍射数据是在Hilger & Watts线性衍射仪上用Cuk射线收集的。特别要指出的是，大量复杂的计算工作全是用自己编制的计算程序在当时惟一可以使用的国产109丙机上完成的，而计算结果的正确性又是用手摇计算机甚至是用计算尺一一校验的。
所得到的2.5分辨率的MIR电子密度图清晰地显示出胰岛素分子的边界和肽链的走向，几乎全部氨基酸残基的侧链均可以确定。在此阶段，同时确定了与胰岛素分子紧密结合的60个水分子。
在三方二锌胰岛素晶胞中，两个胰岛素分子形成一个二聚体，三个二聚体又通过位于三重轴上的两个锌原子形成一个六聚体(图14. A)。一个胰岛素分子共含有三段a螺旋结构，它们是A链的A1—A9、A12—A19螺旋，B链的B9—B19螺旋 (图14. B)。两个胰岛素分子通过C—末端的β反平行折叠构成二聚体。大多数的疏水残基集中于分子内部形成疏水内核，极性残基多分布于分子表面。这是第一次将胰岛素这个神秘的蛋白质分子真实的空间形象展示在人们面前。从而，胰岛素研究也被推进到三维结构的分子水平。
A. 胰岛素分子的六聚体
B. 胰岛素分子单体
图14 胰岛素分子的三维结构
1.8A分辨率的结构研究是在2.5A分辨率结果的基础上进一步改进了晶体和重原子衍生物的质量，分辨率扩展到1.8A。高分辨率的电子密度图比2.5A更加清晰、精细而肯定。在结构精化的基础上，发现了在一个不对称单位中的两个胰岛素分子的二级结构有较明显的不对称性，对胰岛素分子侧链分布的特征、分子构象特征以及胰岛素分子与受体分子间可能的原发作用进行了初步探讨。
2.胰岛素三维结构与功能研究 由三段α螺旋组成的胰岛素的特征结构的不变性和由N—端和C—端伸展肽段展示的局部构象的可变性构成了胰岛素分子三维结构的特征，而正是具有这种特征的三维结构蕴藏了胰岛素分子参与生物事件的基本要素。已有越来越多的研究结果表明，胰岛素发挥生物功能的第一步是与受体的识别和结合，进而诱发一系列生物事件，导致各种生物功能的发挥。在测定了胰岛素的晶体结构之后，原参加胰岛素晶体结构测定的部分研究人员不失时机地将研究重点转入胰岛素三维结构与功能关系研究上来，并确定了两个研究方向：一是在尽可能高的分辨率上获得尽可能精确而完整的三维结构信息。二是在缺乏胰岛素受体来源的情况下，测定各种不同胰岛素类似物和突变体以及各种胰岛素复合物的结构，研究不同的残基改变与三维结构和生物活性之间的联系。这些研究工作均先后获得了有意义的结果：
(1)1.2A高分辨率胰岛素结构研究。在进一步改进晶体质量后，在四圆衍射仪上收集了1.2A特高分辨率的衍射数据，精化后的结构模型提供了许多精细而准确的结构信息，包括分子内和分子之间的氢键体系，精确确定了184个水分子的坐标和水结构类型;在电子密度图上直接观察到80%的氢原子的密度，并探测到A6—A11的二硫键中硫原子的各向异性热运动表现等，其中氢原子和各向异性热运动均为当时国际上首次报道。
(2)一系列胰岛素类似物的结构研究。包括B链羧端去三肽胰岛素、去四肽胰岛素、去五肽胰岛素、去六肽胰岛素、去七肽胰岛素以及各种A链和B链修饰的胰岛素。其中B链羧端去五肽胰岛素是胰岛素系列中第一个以单体形式测定的结构，虽然在B链羧端去掉了五个氨基酸但仍保持相当高的生物活力，也基本保持了二锌胰岛素六体中观察到的胰岛素分子的三维结构的基本特征。B链羧端去七肽胰岛素则基本丧失了胰岛素分子的生物活力 (<1%)，但它仍然可以被结晶，并测定了结构。在大量的被修饰改造并被测得结构的胰岛素类似物和突变体中，由我国测定的结构已超过20个。这些结构均在不同方面为探讨胰岛素结构与功能关系提供了有益的知识。
(3) 在总结已获得的各种胰岛素三维结构信息的基础上，对胰岛素分子与受体分子结合机制进行了探讨，包括提出了胰岛素分子与其受体分子结合的可能机制、分子构象的柔性和运动特征等。这些均为胰岛素研究的深入和相关的蛋白质工程及药物设计提供了可贵的结构基础。
胰岛素晶体结构是我国科学工作者独立完成的第一个蛋白质的三维结构，它使我国成为早期(20世纪60年代末)涉足生物大分子三维结构领域的少数国家之一。著名晶体学家、诺贝尔奖获得者D. 霍希金(D.Hodgkin)教授先后几次访问中国并专程来核对比较两家实验室分别获得的研究结果，认为中国的电子密度图“质量非常好”，与北京的结果进行核对比较是“非常有价值的”，并在《自然》杂志上发表专文介绍中国的胰岛素研究，认为三方二锌胰岛素晶体结构的论文和1965年的胰岛素全合成的论文一样是“十分出色的胰岛素论文”。
由中国科学院主持的“胰岛素晶体结构分析研究成果鉴定意见”的评价是“胰岛素晶体结构的测定是继我国在世界上第一个人工合成了蛋白质——结晶牛胰岛素后，在测定蛋白质晶体结构的研究方面赶超世界先进水平的又一较为重要的成果; 这为研究胰岛素结构与功能的关系提供了新的有利条件，而且也为今后研究生物大分子空间结构打下了基础”。
胰岛素晶体结构的测定及随后开展的三维结构与功能关系的研究，获得了科学界的充分肯定和高度评价。胰岛素晶体结构协作组首先于1978年获全国科学大会奖。随后，“猪胰岛素晶体结构测定”获国家自然科学奖二等奖(1982)，“1.2高分辨率高精度的胰岛素晶体结构研究”获中国科学院科技进步一等奖(1986)。随后以高分辨率和去五肽胰岛素为主的研究工作又获1989年度国家自然科学二等奖。这些奖项是对胰岛素三维结构研究的充分肯定和最好的评价，也在生物大分子晶体学和胰岛素研究史上记录下了中国科学工作者闪光的足迹。实际上，胰岛素晶体结构的测定标志着中国的蛋白质晶体学研究的正式开始，也为后来我国结构生物学研究的开展奠定了基础。