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Production of Vitamin C by Two Steps Fermentation
简介
维生素C (Vitamin C) 即L-抗坏血酸(L-Ascorbic acid)，是人体必需的一种维生素，生理作用广泛，在医药、食品工业和农业上均有重要用途。2-酮基-L-古龙酸 (2-Keto-L-gulonic acid)是合成维生素C的重要前体。长期以来，国内外维生素C生产一直沿用德国化学家Reichstein等于1933年发明的“莱氏法”老工艺。该工艺需要经过五道繁杂的工序 (一步发酵，四步化学合成及精制工序)，连续操作有困难。
“二步发酵法”是由我国于20世纪70年代发明的维生素C生产新工艺，是用微生物发酵产生2-酮基-L-古龙酸用以合成维生素C的新方法。其关键在于筛选到了一种微生物菌株，可以在以D-山梨醇为原料一步发酵得到中间体L-山梨糖的基础上，经过再一次发酵，即可获得2-酮基-L-古龙酸，取代了“莱氏法”老工艺的酮化和化学氧化工序。和老工艺相比，用生物氧化代替了化学氧化，去掉了酮化工序，缩短了生长周期，节省了大量易燃、易爆和有毒的重要化工原料，减少了对“三废”的处理，并大大改善了劳动条件，有利于安全生产。采用“二步发酵法”后可减少工业用粮40%左右，降低了原材料成本。“二步发酵法”新工艺已在国内的维生素C工业生产中推广使用。多年实践证明了“二步发酵法”新工艺技术可靠并具有较高的生产水平。
1967年夏天，北京制药厂等多家工厂沿用“莱氏法”工艺生产维生素C时发生了因一步发酵工序中严重污染噬菌体而影响生产，甚至一度造成了停产。1969年2月，由中国科学院微生物研究所和北京制药厂的工程技术人员组成攻关小组，以改进“莱氏法”生产工艺和提高维生素C生产水平。他们采集了上万个土 (水)样品进行微生物菌株的分离和初步筛选，将复筛菌株的发酵液用纸层析等方法逐一进行定性检测，从中获得能显出产生2-酮基-L-古龙酸斑点的样品两千多个，再进一步进行菌株重复筛选和摇瓶发酵试验，终于在1970年7月选育到一种比原先已经获得的产酸菌株的产酸量要高出近20倍的优良出发菌。在研究发酵条件的过程中，观察到这个菌种不像是单一的一株细菌，而且用常规的分离方法也很难分离纯化。1971年2月，东北制药总厂协助完成了对这一优良菌种的分离和纯化，证实了其是由大、小两种细菌组成的混合菌株。1974年6月，国家医药总局主持在北京召开了由全国维生素C生产工厂参加的“二步发酵法”的中试鉴定会，肯定了这一具有中国特色的新工艺。此后，在国家医药总局组织下，继续进行发酵和提取条件的研究以提高中试水平。70年代末期在上海第二制药厂率先实现了扩大规模试生产。在不断改进的基础上，“二步发酵法”新工艺已普遍应用于国内维生素C工业化生产。
维生素C“二步发酵法”第一发明人是尹光琳，她在中国科学院微生物研究所工作期间，于1967年7月起与北京制药厂合作，选育抗噬菌体菌株及其验证。参加工作的有北京制药厂的宁文珠、中国科学院北京微生物研究所的严自正和东北制药总厂的技术员。其后尹光琳在中国科学院上海生物工程研究中心领导的研究小组继续致力于对“二步发酵法”工艺的革新提高，开展了对维生素C生产新方法、新技术的研究。他们在构建葡萄糖基因工程菌和探索维生素C产生菌的代谢工程研究方面都取得了较好进展，1996年以来申请并获受理的共有三项中国专利。
图7 二步发酵法生产L-抗坏血酸(维生素C)
国内维生素C生产目前均采用“二步发酵法”，其工艺流程如下：从葡萄糖高压加氢制成的D-山梨醇是发酵的主要原料，利用生黑 葡 萄 糖 酸 杆 菌 (Gluconobactermelanogenus) 或弱氧醋酸杆菌(Acetobactersuboxydans)先进行第一步发酵，将所生成的L-山梨糖(醪液)于80℃加热10 min后，再加入消过毒的辅料 (玉米浆、尿素及无机盐等)，即可开始第二步由大菌和小菌组成的混合菌株进行的发酵。小菌是主要的产酸菌——氧化葡萄糖酸杆菌 (Gluconobacteroxydans)，而大菌是必不可少的伴生菌，一般采用假单胞杆菌属细菌 (Pseudomonas sp.)或芽孢杆菌属细菌(Bacillus sp.)。为了便于观察细胞形态上的差别，现在大多数工厂均采用芽孢杆菌属细菌(Bacillus sp. )作为大菌。发酵初期，pH约为7.0，此时两菌株生长均很正常，当作为伴生菌的芽孢杆菌开始形成芽孢时，小菌开始产酸，此时应注意定期滴加少量碱液调节pH，以保持产酸的正常进行。发酵终了时，温度略高，pH在7.2左右，此时L-山梨糖已耗尽，而游离芽孢及残存的菌体已逐步自溶，整个发酵产酸过程结束。将发酵液提取并再经化学转化和精制，即可得到维生素C (L-抗坏血酸)。
由氧化葡萄糖酸杆菌 (Gluconobacteroxydans)和芽孢杆菌属细菌(Bacillus sp. )所组成的混合菌株大、小菌的自然合理搭配，是发酵能否成功的关键。早期大菌以营养体为主，出现芽孢时，小菌即开始产酸，当镜检看到发酵液中大菌大多数较早出现游离芽孢而小菌生长旺盛时，则发酵必定成功; 反之，则会延长发酵时间和影响产酸。严防杂菌污染、控制好发酵条件和及时镜检观察将有助于发酵的顺利进行。在“二步发酵法”工艺中，有三株细菌参与了发酵和整个代谢过程，它的酶系也是比较复杂的。从发明成功到发酵工艺确定直至实现维生素C工业化生产，经历了数十年的改进和提高过程，也表明了维生素C“二步发酵法”的确是具有中国特色的新工艺。
维生素C存在于多种新鲜水果和蔬菜中，但在蔬菜和水果中容易受到破坏并难于长期保存，因而大量应用维生素C必须依靠人工合成。在20世纪30年代以前，维生素C是从柠檬中提取的，由于原料价格昂贵，无法满足需要。此后，国内外均采用经过改良的“莱氏法”进行生产，工艺成熟，总转化率60%左右。但生产工序繁复，反应剧烈，对设备要求很高，消耗能量大，劳动强度也大;而反应中所用的大量有毒、有害和易燃、易爆的化学药品如丙酮、次氯酸钠、苯硫酸等造成了环境污染和影响生态环境。从60年代初期起，世界各国科学家就开始了简化维生素C生产工艺的研究。由尹光琳等人发明的维生素C“二步发酵法”是在“莱氏法”的基础上予以改进，用细菌生物氧化 (发酵) 代替了酮化和化学氧化，减少了生产环节，节省了化工原料，降低了生产成本，创造了具有中国特色的技术路线。在不断改进的基础上，“二步发酵法”新工艺已普遍应用于国内维生素C工业化生产。此项发明在1980年4月荣获了国家科委发明二等奖。20多年来，这一技术改革新工艺在下游技术方面也在不断地充实完善，菌株性能一直很稳定，发酵转化率保持在80%左右，维生素C总收率在47%以上，最高可达到55%左右，处于世界领先水平。
除了我国发明的维生素C“二步发酵法”外，世界各国对简化“莱氏法” 的研究至今多数仍停留在实验室阶段。占世界上维生素C总产量约一半的瑞士霍夫曼·罗氏(Hoffmann La-Roche)制药公司，对我国发明的“二步发酵法”产生了浓厚的兴趣，80年代初就向经营对外技术转让的东方科学仪器进出口公司和中国医药对外经济技术合作总公司提出，希望购买这项技术。经过双方代表的协商谈判，维生素C“二步发酵法”新工艺在1985年9月以550万美元的技术转让费成功地转让给了罗氏公司。这是我国对外技术转让中的一个重大项目。此后，罗氏公司又成功地协助尹光琳等六位主要发明人申请了欧洲专利 (European Patent，1988：278，447—A2)。显然，“二步发酵法”新技术对于大量生产维生素C这一人体生长代谢不可缺少的药物和营养必需品具有重要的价值。
维生素C在整个维生素类药物生产中占有十分重要的地位，是世界卫生组织和联合国工业发展组织共同确定的人类26种基本药物之一。在过去的20多年时间里，维生素C的总产量和销售量一直在稳步上升： 1977年全世界销量近21 000吨，1983年达到35 000吨，1989年则为70 000吨左右，1999年全世界维生素C的产量已达到80 000吨以上。据有关专家预测，世界市场对维生素C的需求在今后15年内仍将呈上升趋势。从1995年春季以来，国内不少维生素C生产厂竞相扩产。过多的维生素C对国外其他一些知名的生产维生素C的制药公司 (如瑞士霍夫曼·罗氏公司及日本武田公司等)造成了压力，因而受到在国际市场上控制出口价格的抵制，这也就大大地影响了国内维生素C的生产和销路。以1996年生产为例，当时全国生产设计总能力已达到35 000吨，而实际上生产维生素C仅18 000吨左右 (其中出口量占总产量的77%)。盲目扩产的结果使得大厂减产，小厂停产或转产。由于维生素C在生产和销售中的不正常，因此降低原料成本和提高产品收率成了国内各维生素C生产厂面临的现实问题。可是在出口价格大幅度下降的同时，原料价格又普遍上涨，而主要原料D-山梨醇却大多采用进口，因而相当多的维生素C生产厂 (公司) 即使生产正常，但真正赢利者屈指可数。
对于像维生素C这样的重要医药产品，多年来国内外的研究一直方兴未艾。在维生素C生物合成研究方面，近年来，国外在应用重组DNA技术开展遗传工程研究中取得了重要的新进展。80年代中、后期，美国、瑞士等国成功构建了从葡萄糖直接生成2-酮基-L-古龙酸的基因工程菌，预示了维生素C生产和研究进入了又一个新的里程碑。国内对“二步发酵法”的混合发酵工艺，在菌株的生理特性及代谢途径的研究、对2-酮基-L-古龙酸合成酶系基因的克隆和提高底物浓度、优化发酵条件以及改进提取、碱转化和精制生产工艺等方面，中国科学院上海生物工程研究中心、清华大学、中国科学院沈阳应用生态所以及许多维生素C生产厂 (公司)都相继进行了研究和探索，也已取得了不同程度的进展。中国科学院上海生物工程研究中心尹光琳等人在葡萄糖串联发酵中试取得成功，克隆到了关键酶——2，5-二酮基-D-葡萄糖酸还原酶的基因并已表达成功，还进行了减少或解除旁路代谢的关键酶的研究，在构建从葡萄糖直接产生2-酮基-L-古龙酸合成维生素C的基因工程菌和代谢工程研究方面亦取得了一系列进展。尹光琳等人在对“二步发酵法”这一具有中国特色的发酵工艺的研究中提出，混合菌株利用L-山梨糖经过“山梨酮途径”产生2-酮基-L-古龙酸的代谢过程也就是发酵产酸的反应过程。从分子生物学角度开展对转化机制及产酸小菌氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)在基因工程方面的研究，很有理论意义和实用价值。
随着分子生物学技术和微生物生理学的发展，无论是构建从葡萄糖直接产生2-酮基-L-古龙酸的基因工程菌，或者是在对从L-山梨糖发酵产生2-酮基-L-古龙酸转化机制深入研究基础上进行基因工程方面的研究，以及从D-山梨醇作为底物直接发酵产生2-酮基-L-古龙酸，将是维生素C生物合成研究在今后的发展趋势。鉴于我国在“二步发酵法”方面的优势，最终实现从D-葡萄糖或D-山梨醇直接发酵产生2-酮基-L-古龙酸并合成维生素C是完全有可能的。