多倍体是指体细胞中含有3个或3个以上染色体组的生物个体。三倍体贝类由于细 胞内增加了一套染色体,理论上是不育的。三倍体贝类由于其不育性或育性差,在繁殖季 节,只消耗极少能量用于性腺的发育,使得更多的能量用于生长。同时,二倍体贝类随着 性腺的发育,体内糖原含量下降,使其品质受到较大的影响,而三倍体贝类由于性腺发育 很差,体内继续保持较高水平的糖原含量,具有鲜美的口味。因此,三倍体贝类的生长速 度比二倍体快,个体大,产量高,品质优并可降低繁殖期的死亡率,缩短了养殖周期,是海 水养殖的优良品种。另外,三倍体贝类的育性差,对保护海洋生物的多样性具有重要意 义。
由于三倍体贝类具有生长快、品质优等优点,1981年美国斯坦利(J. G. Stanley)获 得多倍体美洲牡蛎以来就受到了养殖者和消费者的青睐。迄今为止,已在30余种贝类中 进行了多倍体的育种研究。
一、多倍体贝类育种的基本原理
一般情况下,自然界存在的生物体大都是二倍体,即包含着两个染色体组。自然界存 在的多倍体在植物中比较普遍,而多倍体动物则较为罕见,仅存在于某些雌雄同体或单性 生殖动物中。
真核生物的正常有丝分裂是染色体复制一次,细胞分裂一次,在细胞分裂的后期,染 色单体分离,均衡地分配到两个子细胞中。而减数分裂(又称成熟分裂)则是染色体复制 一次,细胞分裂两次,形成四个子细胞,每个子细胞中的染色体数目减半,成为单倍体的配 子。雌雄配子的结合使染色体得以重组,恢复到原来的二倍体,从而保持了生物个体的遗 传稳定性和延续性。
贝类的精子在排放前已经完成两次减数分裂过程,而卵子在排放时则没有完成减数 分裂,一般停止在第一次减数分裂的前期或中期,在受精后或经精子激活后再继续完成两 次减数分裂,释放两个极体后,雌雄原核融合或联合,进入第一次有丝分裂,即卵裂。这一 延迟了的减数分裂过程为贝类多倍体育种操作提供了有利的时机和条件。
1.抑制受精卵第二极体释放的染色体分离方式
抑制受精卵第二极体的释放可以使一套染色体保 留,产生三倍体。以太平洋牡蛎为例,太平洋牡蛎的染 色体数目为2n=20,受精时,精子已完成减数分裂,染 色体数目减半,仅有10条染色体,而卵子则处于第一次 减数分裂的前期,含有20条染色体。受精后,卵子继续 减数分裂过程,同源染色体向两极移动,20条染色体均 分为两组,每组10条,其中靠近卵子边缘的一组染色体 形成第一极体排出。剩下的一组(10条)染色体继续第 二次减数分裂,染色单体分开,向两极移动,每一极含有 10条染色单体,靠近卵缘的一极将形成第二极体排出。 在第二极体排除之前,给受精卵施加适度的处理,使得 形成第二极体的那10条染色体保留下来,这样卵子中 就含有两组染色体(20条),与精核中的一套(10条)染 色体结合后,即形成了三倍体(3n=30)(图6-1)。
图6-1 抑制太平洋牡蛎受精卵
第二极体产生三倍体的 模式图解(从Guo,1991)
2.抑制受精卵第一极体的染色体分离方式
第一极体的抑制导致第二次减数分裂过程中染色 体分离复杂化,结果产生大量的非整倍体,影响胚胎的 孵化率和幼虫的存活率。Guo等(1992a)利用CB抑制 了太平洋牡蛎第一极体的排出,发现除了产生一定比例 的三倍体(15.6%)、四倍体(19.4%)以及少量的二倍体 (4.5%)胚胎外,还产生了高比例的非整倍体(57.6%),其染色体数目主要分布在23~25 和35~37两个区域内。对牡蛎受精卵的细胞学观察研究(Guo等,1992b)中发现,经CB 处理抑制第一极体释放后,在第二次减数分裂过程中,染色体的分离有以下几种方式(图 6-2):
(1)联合二极分离(United Bipolar Segregation)。两组二分体联合成一体以二极分 离的形式进行第二次分裂,20条染色单体作为第二极体被排出,20条染色单体保留于卵 核中。这一过程相当于一次有丝分裂,其结果产生了MI三倍体(图6-2-B)。
(2)随机三极分离(Randomized Tripolar Segregation)。这种分离方式中形成三极纺 锤体,两组二分体结合成一群,然后20个二分体(每组10个)被随机地分成3组,每组6 ~7个,在第二次减数分裂中期时分布在三极纺锤体的3个分裂面上,随后进入后期Ⅱ。 至末期Ⅱ时,三极中的每一极接受来自相邻两组的二分体分离出的染色单体(平均13~ 14条)。末期Ⅱ以后,三极中的3组染色(单)体各自凝缩,其中最靠近卵子边缘一极的那 组作为第二极体被排出(图6-2-C),其结果导致了非整倍体的产生。
图6-2 抑制太平洋牡蛎受精卵第一极体释放染色体分离方式模式图解(从Guo,1991)
(3)非混合三极分离(Unmixed Tripolar Segregation)。在这种分裂方式中也形成三 极纺锤体。来自第一次减数分裂的两组二分体在进入三极分离前不结合或重叠,而是其 中一组二分体等分到两个靠近边缘的分裂面中,另一组二分体则仍然保持在一起,位于靠 内侧的分裂面中。因此,一套(10个)染色(单)体可能移动到边缘一极而作为第二极体被 排出,其余的30个母本染色(单)体与10个父本染色(单)体结合而形成四倍体(图6-2- D)。
(4)独立二极分离(Seperated Bipolar Segregation)。这种方式的分裂中形成四极纺 锤体,两组二分体各自以二极分离方式独立进入第二次减数分裂。至末期时,所有染色 (单)体被均分至4个极。由于作为第二极体排出的染色(单)体数目不同,将分别导致四 倍体、三倍体或二倍体的产生(图6-2-E)。
在实验中,通过“联合二极分离”或“独立二极分离”方式使两套染色单体作为第二极 体排出,导致MI三倍体产生的比例为14%;由“非混合三极分离”或“独立二极分离”方式 使一套染色单体作为第二极体排出,产生MI四倍体的比例为20%;非整倍体主要通过 “随机三极分离”方式形成,其产生比例为56%,这些非整倍体一般都不能存活下来。
二、多倍体贝类育种的一般方法
目前,贝类多倍体的研究主要集中在三倍体和四倍体。三倍体贝类具有生长快、个体 大、肉质好等特点,且由于三倍体具有三套染色体组,减数分裂过程中染色体的联合不平 衡导致三倍体的高度不育性,能形成繁殖隔离,不会对养殖环境造成品种污染;四倍体贝 类具有进行正常繁育的可能,与二倍体杂交可产生100%的三倍体,能够克服物理或化学 方法诱导三倍体的缺点,更加安全、简便、高效地获得三倍体。
1.三倍体的诱导方法
(1)抑制受精卵第二极体的释放:根据牡蛎的受精和发育特点,抑制第二极体的释放 可以诱发三倍体,这是目前最普遍采用的三倍体诱导方法。常用的诱导方法有以下几种:
1)化学方法。化学方法主要是利用能够抑制分裂的化学物质来干预细胞分裂的过 程,从而达到预期的目的。常用的化学药品有细胞松弛素B、6-二甲基氨基嘌呤、咖啡因 等。
细胞松弛素B(Cytochalasin B,简称CB):真菌的一类代谢产物。一般认为CB抑制 胞质分裂的机制是特异性地破坏微丝,抑制细胞的分裂。有效的使用浓度是0.5~1.0 mg/L,处理时间为10~15 min,一般溶解在0.1%的二甲亚砜中使用。CB在三倍体诱导 中使用最早、最广泛,其诱导效果也最突出。但是CB对胚胎的毒害作用也很强,经CB处 理的受精卵,其胚胎孵化率和以后的幼虫成活率都明显低于二倍体对照组。由于CB为 剧毒物质,有致癌性,已被禁止用于生产。
6-二甲基氨基嘌呤(6-dimethylaminopurine,简称6-DMAP):嘌呤霉素的一种类似 物,是一种蛋白质磷酸化抑制剂,通过作用于特定的激酶,破坏微管的聚合中心,使微管不 能形成。6-DMAP的适宜浓度范围为300~450 μmol/L,处理持续时间为10~20 min。 6-DMAP低毒且易溶于水,其诱导效果可以与CB相媲美,是目前被认为能够替代CB的 新型诱导剂。
咖啡因(Caffeine):咖啡因的作用效果在于提高细胞内的Ca2+浓度,而构成细胞分裂 过程中的纺锤丝的微管对Ca2+浓度非常敏感,在微管自装配中Ca2+起作用,Ca2+浓度极 低或高于10-3时,会引起微管二聚体的解聚,阻止分裂。咖啡因的有效浓度为5~15 mmol/L,处理时间为10~15 min,如果咖啡因和热休克结合使用,诱导效果更显著,但是 胚胎孵化率较低。
2)物理方法。常用的物理方法有温度休克法(包括高温和低温休克法)和水静压。 温度休克法:温度休克的机制是引起细胞内酶构型的变化,不利于酶促反应的进行, 导致细胞分裂时形成纺锤丝所需的ATP的供应途径受阻,使已完成染色体加倍的细胞 不能分裂。温度休克包括热休克和冷休克两种,一般热休克采用30℃~35℃的高温,冷 休克采用0℃~8℃的低温,处理持续时间为10~20 min。温度休克法诱导三倍体,操作 简单,成本低廉,尤其是低温休克法对胚胎发育的影响较小,适合于大规模的生产。
水静压:即将水静压设备(液压机等)产生的压力施加于处理对象。其机制主要是抑 制纺锤体的微丝和微管的形成,阻止染色体的移动,从而抑制细胞的分裂。常用的压力范 围是200~500 kg/cm2,根据应用种类的不同而有所改变,处理时间为10 min左右。
(2)利用四倍体与二倍体杂交产生三倍体:利用四倍体与二倍体杂交可产生100%的 三倍体,这在植物及鱼类有了成功的先例,如在鱼类中通过四倍体与二倍体杂交获得了三 倍体虹鳟(Chourrout,1986),在贝类中通过此法产生了100%的三倍体太平洋牡蛎(Guo 等,1996a)。
通过四倍体(T)与二倍体(D)杂交生产三倍体贝类,三倍体率可高达100%,方法简 单,操作方便,避免了理化处理对胚胎发育的影响,能提高胚胎孵化率和幼虫成活率,是生 产三倍体贝类的最佳方法,也是控制种群、保护生物多样性的最为理想的方法。但这种方 法需要四倍体的培育。
2.四倍体的育种方法
目前,四倍体的产生主要有两种途径。
(1)利用二倍体直接诱导四倍体:利用理化方法使二倍体的染色体加倍直接产生四倍 体的方法已成功地应用于植物、两栖类及鱼类四倍体研究中。这种方法在贝类中也有过 很多尝试,大多数都诱导出四倍体的胚胎或幼虫,但具存活能力的四倍体则鲜有报道。从 二倍体直接诱导四倍体主要有抑制第一极体或同时抑制两个极体的释放、抑制第一次卵 裂、细胞融合和人工雌核发育等方法。
1)抑制极体的释放:抑制第一极体的释放能导致随后的第二次减数分裂中染色体分 离的复杂化,通过非混合的三极分离方式和独立二极分离方式,能够产生四倍体胚胎 (Guo等,1992b)。
利用抑制第一极体的方法已在美洲牡蛎(Stanley等,1981)、太平洋牡蛎(Stephen和 Downing,1988;Guo等,1992)、近江牡蛎(Rong等,1994)、菲律宾蛤仔(Diter和Dufy, 1990)、贻贝(Yamamoto和Sugawara,1988)和皱纹盘鲍(Arai等,1986)等贝类中诱导出 四倍体胚胎,但均没有培育至成体。
同时抑制第一极体和第二极体的释放也可能产生四倍体。两个极体都被抑制之后, 受精卵中存在五套染色体,精卵原核融合时有可能产生五倍体,但有时由于两个原核融合 不彻底也有可能产生四倍体或是其他倍性的胚胎。
2)抑制第一次卵裂:利用抑制第一次卵裂的方法成功地获得了可存活的四倍体鱼 (Chourrout,1984; Myers等,1986),且四倍体鱼可通过自群繁殖延续下来(Chourrout 等,1986)。但是,抑制卵裂诱导四倍体的方法在贝类中的应用并不像在鱼类中那样广泛 和成功。Guo等(1994)利用热休克(35℃~40℃)抑制太平洋牡蛎的第一次卵裂,得到了 45%的四倍体胚胎,但仅成活到D形幼虫。蔡国雄等(1996)利用6-DMAP抑制紫贻贝的 第一和第二次卵裂以诱导四倍体,分别产生了82.8%和58.6%的四倍体胚胎。杨蕙萍等 (1997)利用CB抑制栉孔扇贝的第一次卵裂,胚胎四倍体率为20%~30%。迄今为止,还 没有见到利用这一途径获得四倍体贝类成体的报道。
3)细胞融合:通过对两个细胞施加一定的处理,使其细胞膜融合,成为一个细胞,最终 形成四倍体聚乙二醇目前最为常用,效果较好的融合剂,脂质体、激光和电融合也有一定 的应用价值。
4)人工雌核发育:利用人工雌核发育来诱导四倍体的技术路线是通过精子染色体失 活,再同时阻止第一、二极体释放来实现的。精子染色体的失活方法在第二部分——细胞 遗传操作方法中已经谈到,包括辐射处理(主要是紫外线)和化学处理,随后的极体释放的 抑制方法和在三倍体及四倍体诱导中谈及的抑制极体释放的方法是一致的。
(2)利用三倍体贝类诱导四倍体:这种方法利用三倍体贝类产生的卵子与正常精子结 合,然后抑制第一极体,可产生存活的四倍体(Guo和Allen,1994a)。由于利用二倍体直 接诱导四倍体难度很大,Guo等根据对实验结果的分析研究及以往的工作经验认为,通过 二倍体直接诱导产生的四倍体太平洋牡蛎胚胎不能成活的原因是由于较大的四倍体核在 正常体积的卵中卵裂造成细胞数目不足引起的。增大卵子体积可能解决四倍体胚胎发育 中细胞数量不足的问题。目前已尝试过两种途径:一是合子融合。但由于融合率低及融 合后发育异常,使合子融合在技术上难于成功(Guo等,1994)。二是利用较大体积的卵 子。一般情况下,正常二倍体产生的卵子,其大小变异不大,但三倍体产生的卵子却明显 大于二倍体产生的卵子(体积增加54%),可能有利于产生具生活力的四倍体。基于这种 可能性,Guo和Allen(1994a)尝试了一种崭新的思路和方法,即利用三倍体太平洋牡蛎 的卵与正常精子结合后,以CB处理抑制其第一极体的排放,首次成功地获得了可存活的 四倍体太平洋牡蛎。
三、多倍体的倍性检测方法
1.染色体分析法
(1)常规滴片法:选取胚胎、早期幼虫(如担轮幼虫)或幼贝的鳃组织依次经0.005% ~0.01%秋水仙素处理(15~40 min)、0.075 mol/L KCl低渗(10~30 min)、Carnoy’s固 定液固定(甲醇:冰醋酸=3:1)、50%醋酸解离(5~10 min)、细胞悬液滴片(冰冻或热滴 片)制成染色体标本、吉姆萨(Giemsa)或Leishman染色,镜检观察染色体。这种方法能 得到清晰的染色体分裂相,是鉴定多倍体最精确的方法。
(2)压片法:此种方法常用于观察早期胚胎染色体,具体的压片方法和常规的生物制 片的方法相同。常用的染色方法有乙酸地衣红染色及苏木精-铁明钒-醋酸染色。
2.流式细胞术(Flow Cytometry)
用DNA-RNA特异性荧光染料(如4,6-diamidino-2-phenylindole即DAPI)对细胞进 行染色,在流式细胞计上用激光或紫外光激发结合在细胞核的荧光染料,依次检测每个细 胞的荧光强度,因DNA含量的不同得到荧光强度的不同分布峰值,与已知的二倍体细胞 或单倍体细胞(如同种的精子)荧光强度对比,判断被检察细胞群体的倍性组成。
3.极体计数法
正常二倍体的受精卵产生两个极体,而三倍体由于第二极体受到抑制,只形成一个极 体。计数受精卵和早期胚胎中的极体数目是一种快速、简便的检测倍性方法。
4.核径测量法
二倍体与三倍体细胞核直径大小不等,其理论比值为1:1.145。通过测量胞核的方 法有可能区分开二倍体与三倍体,从而达到鉴定三倍体的目的。应用这一方法只需高倍 显微镜及常规的微生物学研究的仪器设备,简便易行。但该方法与染色体分析法、流式细 胞术等方法相比,尚无足够的说服力,其鉴定倍性水平的有效性并未得到广泛承认。
5.电泳方法
通过比较呈现杂合表型的同工酶各组成电泳酶带的相对染色强度,进行倍性判断。 如对单体酶来说,二倍体两条带的染色强度是相等的,而三倍体两条带的染色强度则为 2:1,有时还可能表现为三条带。对二聚体酶来说,其三条带的相对染色强度在二倍体中 为1:2:1,在三倍体中则为4:4:1。该方法可快速检测大样品的倍性,但只有高度杂 合的基因位点才能给出有效的信息。
6.核仁计数法
二倍体牡蛎血细胞只有1或2个核仁,三倍体牡蛎血细胞的核仁以2~3个为主。根 据血细胞中核仁的数目可以区分二倍体和三倍体牡蛎。
四、多倍体育种的染色体操作方法与结果
1981年美国学者Stanley用0.5 mg/L的CB处理美洲牡蛎的受精卵获得多倍体以 来,贝类多倍体育种研究进展很快,各国学者对太平洋牡蛎、美洲牡蛎、大连湾牡蛎、褶牡 蛎及其他近30余种贝类进行了多倍体诱导,并对各种诱导方法进行了探索。由于对处理 的时机和处理强度掌握不同,其诱导的结果差异很大。常见贝类多倍体诱导的方法及结 果见表6-2。
表6-2 主要经济贝类多倍体操作方法与结果
种类 | 作者 | 诱导方法 | 诱导强度 | 最佳诱导结果 |
太平洋牡蛎
Crassostrea gigas (Thunberg) |
Chaiton & Allen(1985) | 水静压 | 6 000~8 000 psi | 3n幼虫57% |
Allen & Downing(1986) | CB | 3n幼虫96% | ||
Quillet & Panelay(1986) | 热休克 | 38℃ | 3n胚胎60% | |
Stephens & Downing(1988) | CB | 1 mg/L | 3n幼虫75%
4n幼虫91% |
|
山本(1989) | 咖啡因+热休克 | 5 mmol/L+32℃
10 mmol/L+34℃ |
3n幼虫71%
4n幼虫4% |
|
Cadoret(1992) | 电脉冲 | 600 V/cm | 3n幼虫55%
4n幼虫20% |
(续表)
种类 | 作者 | 诱导方法 | 诱导强度 | 最佳诱导结果 |
太平洋牡蛎
Crassostrea gigas (Thunberg) |
Desrosiers et al.(1993) | 6-DMAP | 300 μmol/L
1 mg/L |
3n幼虫90%
3n胚胎100% |
CB | ||||
Guo et al. (1994) | 热休克
合子融合 |
35℃~40℃
PEG |
4n胚胎45%
4n胚胎30% |
|
Guo & Allen (1994a) | 种间杂交+CB | 3n×2n+CB | 4n幼贝67% | |
Guo et al.(1996) | 种间杂交 | 4n×2n | 3n幼虫100% | |
田传远等(1999) | 6-DMAP | 450 μmol/L | 3n胚胎93.8% | |
美洲牡蛎
C.virginica (Gmelin) |
Stanley et al.(1981) | CB | 0.5 mg/L | 3n胚胎50% |
Barber et al.(1992) | CB | 0.25 mg/L | 3n幼虫96% | |
Scarpa et al.(1995) | 6-DMAP | 400 μmol/L
0.5 mg/L |
3n胚胎15%
3n胚胎100% |
|
CB | ||||
大连湾牡蛎
C.talienwhanesis Crosse |
梁英等(1994) | 冷休克 | 4℃~5℃ | 3n胚胎72%
3n幼贝64.6% |
褶牡蛎
C.plicatula Gmelin |
付勤洁等(1997) | 冷休克 | 0℃~2℃ | 3n胚胎69.5% |
马氏珠母贝
Pinctada martensii (Dunkeer) |
姜卫国等(1987) | CB
冷休克 |
1.2 mg/L
12℃ |
3n胚胎76.8%
3n胚胎52.6% |
Wada et al. (1989) | CB | 3n幼虫100% | ||
Shen et al.(1993) | 水静压 | 200~250 kg/cm2 | 3n胚胎76% | |
何毛贤等(1999) | 6-DMAP | 75 mg/L | 3n胚胎90% | |
栉孔扇贝
Chlamys farreri (Jones et Preston) |
王子臣等(1990) | 冷休克
热休克 |
1℃
30℃ |
3n胚胎30.4%
3n胚胎27.6% |
吕隋芬、王如才(1992) | CB | 0.5 mg/L | 3n胚胎50% | |
杨蕙萍等(1997) | CB抑制Pb1 | 0.5 mg/L | 3n胚胎38.38%
4n胚胎39.75% |
|
杨爱国等(2000) | 6-DMAP | 60 mg/L | 3n幼虫87.04% | |
虾夷扇贝
Patinopecten yessoensis (Jay) |
王子臣等(1990) | 热休克 | 29℃ | 3n胚胎26.7% |
华贵栉孔扇贝
Chlamys nobilis (Reeve) |
Komaru & Wada(1989) | CB | 0.5 mg/L | 3n幼贝71.4% |
Komaru et al.(1989) | 水静压 | 200 kg/cm2 | 3n幼贝23.3% | |
林岳光等(1995) | CB
冷休克 |
5 mg/L
10℃ |
3n胚胎90.2%
3n胚胎72.7% |
(续表)
种类 | 作者 | 诱导方法 | 诱导强度 | 最佳诱导结果 |
海湾扇贝
Argopecten irradians (Lamarck) |
Tabarini(1984) | CB | 1 mg/L
0.05 mg/L |
3n 1龄贝94%
3n 1龄贝66% |
贻贝
Mytilus edulis Linnaeus |
Yamamoto & Sugawara
(1988) |
热休克
冷休克 |
32℃
1℃ |
3n幼虫97.4%
3n幼虫85.3% |
Beaumont & Kelly(1989) | CB
热休克 |
1~1.0mg/L
25℃ |
3n胚胎67%
3n胚胎25% |
|
蔡国雄等(1996) | 6-DMAP | 400 μmol/L | 4n胚胎82.8% | |
菲律宾蛤仔Ruditapes philippinarum
(A Adams et Reeve) |
Dufy et al.(1990) | CB | 1 mg/L | 3n胚胎75.8% |
Diter et al.(1990) | CB | 1 mL/L | 4n胚胎64.4% | |
缀金锦蛤
R. semidecussatus |
Beaumont & Contaris (1988)
Gosling & Nolan(1989) |
CB
热休克 |
5 mg/L
32℃ |
3n胚胎81.8%
3n胚胎55% |
砂海螂Mya arenaria (Linnaeus) | Allen et al.(1982) | CB | 1 mg/L | 3n胚胎75% |
Mason et al.(1988) | CB | 1 mg/L | 3n稚贝45% | |
毛蚶Scapharca subcrenata(Lischke) | Ueki(1987) | 冷休克
CB |
2℃~6℃
0.5 mg/L |
3n幼虫20%
3n幼虫76% |
文蛤Meretrix meretrix (Linnaeus) | 常建波等(1996) | 冷休克
热休克 |
8℃
32℃ |
3n胚胎53.1%
3n胚胎40% |
皱纹盘鲍Haliotis discus hannai Ino | Arai et al.(1986) | 冷休克
热休克 静水压 |
3℃
35℃ 200 kg/cm2 |
3n幼虫70%~80%
3n幼虫60%~80% 3n幼虫60% |
孙振兴等(1993) | 冷休克 | 3℃ | 3n幼虫53.6% | |
孙振兴等(1998) | CB | 1 mg/L | 4n胚胎21.9% | |
杂色鲍Haliotis diversicolor Reeve | 容寿柏、翁得全(1990) | 冷休克 | 8℃~11℃ | 3n胚胎66%~69% |
Kudo et al.(1991) | 冷休克 | 3℃ | 3n幼贝70% | |
严正凛等(1999) | CB
咖啡因 |
0.4~0.6
mmol 5.0 mmol |
3n胚胎59%
~76.2% 3n胚胎33.3% |
四、多倍体贝类的主要生物学特性
1.存活能力
三倍体的贝类是可以存活的,但与正常的二倍体相比,三倍体的幼虫成活率一般较 低。三倍体幼虫较低的存活率一般认为不是由于倍性引起的,而主要是其他因子,如诱导 处理时诱导剂潜在的毒性影响或者由于第二极体的抑制导致致死基因的纯合等。
在人工诱导贝类三倍体时,无论是用温度休克、静水压等物理方法处理,还是使用 CB、咖啡因等药物进行化学处理,都会对卵子的发育、胚胎与幼虫的存活产生一定的影 响,而且随着处理强度的加大,三倍体处理组的胚胎孵化率及幼虫存活率较二倍体对照组 明显降低,或是处理组胚胎畸形率呈上升趋势。对CB处理的皱纹盘鲍的受精卵的电镜 观察表明,CB的毒害作用是通过破坏受精卵内的细胞器,从而导致代谢缺陷来实现的,这 种毒害作用随着CB浓度的加大而增强(孙振兴,1997)。CB处理常引起牡蛎幼虫的死亡 率达到90%以上(Barber等,1992; Allen和Bushek,1992),一般认为D形幼虫的存活率 与CB浓度及处理时间直接相关。太平洋牡蛎的受精卵经CB处理后,24 h的D形幼虫 率仅为2%,而对照组为35%,至眼点幼虫的存活率为0.4%,而对照组为5.5%(Guo等, 1996a)。
也有研究报道,三倍体处理组与对照组从浮游幼虫到稚贝阶段的存活率并无明显差 异(Stanley等,1981;Downing和Allen,1987)。在大规模的生产中,用冷休克处理太平 洋牡蛎的受精卵,其胚胎孵化率和幼虫成活率也与二倍体对照组无明显差异。
三倍体贝类在养成阶段的存活率与二倍体无明显差异,如Guo等(1996a)对40天至 8月龄的太平洋牡蛎、Allen和Downing(1986)对8个月龄至2年龄的三倍体太平洋牡 蛎、Komaru和Wada(1989)对5~17月龄的三倍体华贵栉孔扇贝以及林岳光等(1996)对 0.5~5龄的三倍体合浦珠母贝的观察结果都表明,成贝的死亡率在三倍体与二倍体之间 无明显差异。
四倍体贝类的生活力明显低于三倍体和二倍体。通过抑制受精卵第一极体的排放及 抑制第一次卵裂等方法在太平洋牡蛎、近江牡蛎、栉孔扇贝、贻贝、地中海贻贝等多种贝类 中获得了四倍体胚胎,但仅在地中海贻贝和菲律宾蛤仔检测到了个别存活到变态的四倍 体,其他皆不存活。其原因可能有二:①有缺陷的隐性基因的纯合;②核质不平衡引起的 发育和遗传障碍使幼虫难以发育下去。Guo和Allen(1994a)在对太平洋牡蛎的研究中, 利用三倍体产生的体积较大的卵子,与正常的精子结合后抑制第一极体的排放,获得了具 有存活能力的四倍体,但成活率极低,在3个处理组中仅一组存活至变态,存活率仅为 0.073 9%,其余两组全部死亡。这些存活下来的四倍体牡蛎在3月龄时,个体明显大于 其同胞二倍体和三倍体。
2.性腺发育及繁殖力
三倍体由于体细胞中增加一套染色体,通常被认为是不育的(Thorgaard,1983)。但 三倍体贝类的不育性不是绝对的。Allen和Downing(1986)报道,从外观上看,三倍体太 平洋牡蛎的性腺发育程度较差,雄性的性腺发育程度仅为二倍体的一半,而雌性的卵巢发 育程度仅为正常二倍体的1/4。马氏珠母贝、硬壳蛤及华贵栉孔扇贝等三倍体性腺受抑 制程度更严重,三倍体马氏珠母贝仅有个别个体的配子能发育至增殖期(姜卫国等, 1990)。
尽管三倍体的性腺发育程度较差,有些三倍体的性腺也能产生成熟的精子或卵子,但 是其繁殖力明显低于二倍体。发育成熟的三倍体贝类能产生较大的生殖细胞。三倍体太 平洋牡蛎及侏儒蛤的卵子体积比二倍体大53%(Guo和Allen,1994b)。三倍体牡蛎的 精子的头部、顶体及鞭毛都明显比二倍体的大(Komaru等,1994)。三倍体产生的配子是 可以受精的,三倍体卵子受精后,同二倍体卵子一样,经过两次减数分裂并释放出两个极 体。
关于三倍体贝类繁殖力比较研究的文献很少,对三倍体动物的不育性研究大多局限 于性腺发育的组织学观察。1龄的三倍体太平洋牡蛎群体中,所有的雄性都能产生精母 细胞,大部分能形成精子(Allen和Downing,1990)。三倍体侏儒蛤雌体的繁殖力仅为二 倍体的59%,雄体的繁殖力约为二倍体的80%(Guo和Allen,1994c)。
四倍体贝类是可育的,能够产生成熟的生殖细胞。Komaru等(1995)分析了地中海 贻贝四倍体成体的精原细胞的发生与超显微结构,提出这些精原细胞可能具有可繁育性, 能够和二倍体的卵子结合产生三倍体的后代。Allen等(1994)在CB处理诱导的菲律宾 蛤仔三倍体群中检测出2个偶发的四倍体,对其组织观察发现,四倍体能产生成熟的生殖 细胞。Guo和Allen(1995)报道,1龄的四倍体太平洋牡蛎从外观上看,性腺发育正常,雌 体的怀卵量在140万~420万粒之间。
四倍体贝类能产生较大的生殖细胞。四倍体菲律宾蛤仔卵子的体积比正常二倍体大 41%,四倍体太平洋牡蛎的卵子比二倍体的卵子大70%~80%。四倍体地中海贻贝的精 子顶体高(4.4±0.62)μm,核长(2.04±0.05)μm,核宽(2.14±0.06)μm,鞭毛长(72.3± 2.25)μm;而二倍体顶体高(2.85±0.14)μm,核长(1.85±0.06)μm,核宽(1.78±0.07) μm,鞭毛长(60.55±1.95)μm。
四倍体贝类能与二倍体杂交产生100%的三倍体,正交与反交后代差异不明显,生长 速度都明显快于二倍体对照组。然而,四倍体自群繁殖能力较差,其幼虫发育至稚贝的存 活率仅为二倍体对照组的0.1%(Guo等,1996a)。
3.生长快
几乎在所有研究的贝类中,三倍体贝类的生长都快于相应的二倍体。僧帽牡蛎C. cucullata、大连湾牡蛎及栉孔扇贝三倍体在幼虫时期就表现出生长优势。成体的侏儒蛤、 太平洋牡蛎、马氏珠母贝、美洲牡蛎、华贵栉孔扇贝等贝类的三倍体的生长明显快于相应 的二倍体。养殖两年半的三倍体悉尼牡蛎Saccostrea commercialis比二倍体增重41%, 养殖19个月的三倍体皱纹盘鲍比二倍体增重20.1%,壳长增加10.2%,足肌增重 17.6%。2龄的马氏珠母贝三倍体比二倍体壳高增加13.01%,全重增加44.03%,软体 重增加58.37%。海湾扇贝Agopecten irradians三倍体的闭壳肌及软体重分别比二倍体 增加73%和36%。太平洋牡蛎二倍体在繁殖季节里由于精、卵的排放,体重明显下降(下 降64%),壳的生长停止,而三倍体则保持继续生长。
针对三倍体贝类个体增大或快速生长的现象,现在有三种假说予以解释:第一种假说 是三倍体的杂合度增高假说,认为三倍体的个体增大现象是其杂合度增高的结果。第二 种假说是能量转化假说,认为三倍体生长快于二倍体是由于三倍体的不育性,从而将配子 发育所需的能量转化为生长所致。第三种假说是三倍体体细胞的巨态性假说。由于贝类 的发育属于嵌合型,缺乏细胞数目补偿效应,细胞体积增大而细胞数目并不减少,结果导 致三倍体个体的增大。这三种假说都能解释部分现象,但无法解释所有情况下的三倍体 个体增大现象。我们认为杂合度、能量转化及多倍体细胞的巨态性都不是引起三倍体个 体增大的唯一原因,多倍体的快速生长现象可能是三者共同作用的结果。
4.性比
双壳贝类大多数为雌雄异体,在幼龄群体中,雄性略多于雌性,而在老龄群体中雌性 略多于雄性。繁殖季节里贝类自然群体的性比大致为1:1,但其性别不很稳定,有时存 在雌雄同体及性转变现象。
在抑制极体产生的多倍体群中,雌雄比例与其二倍体对照组无明显差异,如三倍体的 美洲牡蛎、侏儒蛤、珠母贝以及四倍体的太平洋牡蛎等。而雌雄同体的比例较正常二倍体 高得多,在美洲牡蛎三倍体群中雌雄同体比例高达12%,三倍体太平洋牡蛎中雌雄同体 率达20%(Allen,1987),而自然群体中雌雄同体比例一般低于0.1%。然而也有例外, Allen等(1986)发现,在人工诱导的三倍体砂海螂中,77%为雌性,16%具有雌性的组织 学特征,其余7%性腺完全不发育,未发现雄性个体。
在双壳贝类中尚未发现有性染色体存在,对其性别决定机制也所知甚少。仅发现成 熟的雌核发育二倍体侏儒蛤全部表现为雌性,这表明侏儒蛤的性别决定机制可能与果蝇 相同,属于XX(雌)、XY(雄)型(Guo和Allen,1994c)。
5.抗逆性
三倍体贝类由于具有比二倍体多的染色体组而成为非自然种生物,因而适应环境的 能力不同于自然群体。在饥饿130天后,三倍体太平洋牡蛎的死亡率明显高于二倍体,说 明在营养不足的情况下,三倍体的生存能力低于正常二倍体(Davis,1988)。但在产卵 后,正常二倍体由于性细胞排放,体能大量消耗,体质变弱,导致对高温和疾病抵抗力的降 低,往往会大批死亡,而三倍体由于没有或很少精、卵排放,体内糖原储存比二倍体高,体 质和抗逆性可能要比二倍体好。这一点只是假定和初步的观察,还需实验进一步证实。
由于尼尔氏单孢子虫(Haplosporidium nelsoni)(简称MSX)和海水派金虫(Perkinsus marinus)(简称Dermo)两种寄生虫病的蔓延,使美洲牡蛎几近绝产,用多倍体育种解 决牡蛎疾病问题曾被寄予厚望。然而实验表明,三倍体牡蛎对这两种疾病的抵抗能力并 不高于二倍体。感染Dermo 150天后,美洲牡蛎二倍体的死亡率为100%,三倍体为 97.7%,太平洋牡蛎二倍体的死亡率为25.1%,三倍体为34.3%(Meyers等,1991)。
目前对三倍体贝类的生态习性研究较少。有人认为,在优良环境条件下,三倍体贝类 的生长明显快于二倍体,但在恶劣环境里则生长慢于二倍体。优化多倍体的生态环境,发 挥多倍体的生长优势,是发展多倍体产业化亟待解决的问题之一。
6.生理生化指标
在15℃及30℃条件下,1龄的三倍体太平洋牡蛎耗氧率和氨排泄率与二倍体无明显 差异。室温(15℃)条件下,三倍体与二倍体的生化组分(总蛋白、糖类、脂肪及灰分)无明 显差异,而升温(30℃)条件下,三倍体牡蛎的糖原及蛋白水平明显高于二倍体(Shpigel 等,1992)。
糖原的储存、利用与贝类的繁殖密切相关,糖原的含量可反映贝类配子的发生情况。 在配子发育高峰期间,三倍体海湾扇贝的肝糖含量明显高于二倍体(Tabarini,1984)。三 倍体太平洋牡蛎的肝糖含量是二倍体的5倍,并且三倍体雌体的糖原含量明显高于雄体, 为干重的31.3%,而雄体为23.2%。在繁殖季节(从5月上旬至7月中旬),二倍体牡蛎 的糖原含量降低72%,排放后开始回升,而三倍体糖原含量仅降低8%,但在以后的2个 月中持续缓慢下降至原含量的61%(Allen,1987)。繁殖期间,二倍体牡蛎的能量收支处 于负平衡,三倍体则为正平衡(Davis,1988)。
五、贝类多倍体育种的应用现状及发展趋势
1981年,贝类三倍体育种首次在美洲牡蛎中报道成功,1984年美国三倍体太平洋牡 蛎开始进入商业化生产,目前三倍体太平洋牡蛎在美国占养殖产量的30%左右。多倍体 牡蛎的开发成功在美国创造了相当的经济效益,因为二倍体牡蛎在夏天成熟排卵,大大影 响了牡蛎的风味,所以一般牡蛎养殖公司在夏天不生产牡蛎,而三倍体牡蛎的成功开发使 得牡蛎可以全年生产上市,产量提高20%~30%。
多倍体贝类育种在我国也备受重视,近年来对太平洋牡蛎、近江牡蛎、栉孔扇贝、合浦 珠母贝、皱纹盘鲍等重要经济贝类的多倍体育种进行了系统研究,在诱导方法、苗种培育 及规模化生产等方面均取得了可喜的进展,尤其是三倍体太平洋牡蛎的育苗与养殖研究 进展迅速,目前已在较大范围内推动产业化进程。1998~2000年,中国海洋大学在山东 威海、辽宁大连、广东南澳和福建莆田等地利用低温休克、6-DMAP处理等方法诱导太平 洋牡蛎三倍体,获得三倍体群牡蛎苗30多亿,海上养殖14 000余亩,成体牡蛎的三倍体 率达60%以上。三倍体牡蛎的长势良好,深受养殖者的欢迎。
贝类多倍体育种技术率先在牡蛎中获得突破并实现产业化,其主要原因是牡蛎的卵 子成熟同步性较好,可以解剖受精,处理时间容易控制。目前,作为三倍体育种大规模推 广的关键技术——四倍体也已在太平洋牡蛎中诱导成功。四倍体和二倍体杂交产生 100%三倍体的技术已经成熟,并已向生产过渡。四倍体牡蛎自群繁殖技术已突破,能建 立稳定的四倍体品系。四倍体与二倍体杂交产生100%的三倍体,方法简便,高效稳定。 应该说,四倍体是实现三倍体产业化的根本途径。
随着开发海洋步伐的加快,多倍体贝类育种研究还将在更多种经济贝类中开展。可 以预见,在今后几年内,多倍体贝类育种将会在更大范围内实现产业化,并产生更大的经 济效益。