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6.6.1 固定化细胞生产酒精

2023-02-14

6.6.1.1 概述

利用固定化酵母细胞实现酒精连续发酵是酒精发酵工艺的重要发展方向之一。自 20世纪70年代中期固定化技术的应用进入实用化的开发阶段,日本率先完成糖蜜原料 的固定化细胞酒精发酵的中间试验。1979年千烟一郎等人发现,通过不断提供营养物 质,固定化的微生物会在载体中生长繁殖,他们将酵母细胞包埋入角叉菜聚糖,保温振荡 培养,使酵母在凝胶内继续生长,60h后,细胞可增长1000倍以上,达到5.4×109个细胞/ mL胶,10倍于游离细胞培养液。把固定化细胞装柱后连续发酵酒精,半衰期可在90d以 上。即使有些细胞会从凝胶珠中脱落,因胶中细胞数始终维持在109~1010/mL的高水平 上,可达到酒精生产能力15.9g/(L·h)的水平,9倍于游离细胞的最大生产效率。由此,在 固定化休止细胞的基础上发展起来的微生物增殖细胞的固定化技术,在国内外研究十分 活跃。固定化增殖细胞能够长期维持细胞的全部生理功能,有利于实现需要ATP和辅酶 再生的多酶反应过程。固定化酵母增殖细胞生产酒精有两类:即载体固定化和非载体固 定化。前者固定化方法与常用的细胞固定化技术相同,而后者是利用某些酵母在特定条 件下能够自身絮凝形成稳定颗粒的特性,在适宜的生物反应器中进行酒精的连续发酵。

我国对固定化细胞发酵酒精的研究几乎与国际上同步,在“七五”、“八五”期间均列为 国家重大攻关课题,至今,以糖蜜为原料固定化细胞的连续发酵酒精已在生产上普遍采 用,在淀粉质原料中采用载体和非载体固定化酵母增殖细胞的技术也已在酒精生产中成 功应用。

6.6.1.2 固定化细胞发酵酒精常用的固定化方法和固定化反应器

(1) 固定化细胞的方法 常用的方法有吸附法和包埋法。吸附法载体以多孔陶瓷、 多孔玻璃、硅胶粒、玻璃纤维等通过物理吸附方法制备成固定化细胞。包埋法的载体有海 藻酸钠、聚丙烯酰胺凝胶、卡拉胶、琼脂凝胶等。为提高凝胶载体的强度,有时在细胞包埋 后再经戊二醛交联已包埋的细胞,可延长半衰期。表6-41介绍不同固定化方法制成的 酵母细胞生产酒精的能力。

近年来发展起来的固定化增殖细胞比固定化休止细胞更具优越性,其固定化方法基 本相同,只是把固定化酵母细胞装入反应器中后,将培养基通入反应器中培养1~2d,使 载体中酵母细胞数目增殖约1000倍,即每毫升载体含酵母细胞由106增至109,发酵能力 显著提高,表6-42显示两种固定化细胞的酒精生产能力。通过增殖的阶段,即使酵母细 胞起始的数目相等,乙醇的生产能力差别却很大。

表6-41 不同固定化酵母细胞的酒精生产能力的比较

固定化方法 酒精生产能力 固定化方法 酒精生产能力
mg乙醇

/[g/(gel·h)]

mg乙醇

/[mL/(gel·h)]

mg乙醇

/(ggel·h)

mg酒精

/(mLgel·h)

多孔环氧树脂 26 15 海藻酸钙 40 22
尼龙微胶囊 2 1 低甲氧基果胶 35 19
不饱和聚酯 4 2 角叉菜聚糖凝胶 40 22
乙酰丁基纤维素 14 8
多孔聚苯乙烯 14 7 琼脂凝胶 40 22
聚丙烯酰胺凝胶 36 20 甲硅溶液 50 28

注:gel指包埋细胞的凝胶所制成的1g或1mL固定化细胞。

表6-42 固定化增殖酵母与固定化酵母的酒精生产能力比较

  活酵母数目/(个/mL) 酒精生产能力/[mg/(mL·h)]
固定化增殖酵母 6.4×109 50.0
固定化酵母 5.6×109 18.7

如上表所示,将培养基中葡萄糖浓度由10%提高至15%、20%、25%,则发酵液中酒精含量可达114g/L。

图6-31 床型对比示意图

(2) 固定化细胞发酵酒精的反应器型式 酒精发酵中会产生大量的CO2,对发酵不 利,因此选择反应器床型时对CO2的排出、沉 淀物在酵母细胞表面的清除等因素,均需考 虑,常采用的反应器有填充床反应器、并流式 反应器和流动床反应器,见图6-31,详细内容参见本章6.4节。

由于酒精发酵产生大量CO2,从气体的 排除效果考虑,以流动床和并流型固定床为 酒精发酵系统适宜的床型。此外,并流型膜 状固定床还具有一个特点,即在载体填充率10%~70%范围内,可以根据需要选取所要求 的反应器容积效率,并且易于适应操作变动和负荷变动。这一特点,对利用生产上现有发酵 设备改变传统的游离细胞发酵技术为固定化细胞发酵,大幅度提高发酵强度,十分有利。

上述三种反应器进行固定化细胞酒精发酵时,其优缺点如表6-43所示。

6.6.1.3 固定化酵母细胞发酵酒精实例

(1)膜状并流固定床载体固定化增殖酵母细胞淀粉原料的酒精发酵 谢振根等人研 制成功膜状固定化载体JF-3应用于酒精生产取得满意结果。载体材料采用国产的无毒高分子聚合物,基本结构为—CH2—CH(OH)—,制成一种能提供微生物细胞栖居、繁殖 的微循环,具有多孔网格结构的膜状载体。适用于反应过程中大量气体产生与杂质较多 的粗原料酒精发酵工艺。具体方法简述如下:

表6-43 在不同反应器中固定化细胞酒精发酵的比较

反应器型式

性能

填 充 床 并流式固定床 流 动 床
固定化细胞装填率/% <50 10~70 10~30
CO2排出 难(偏流)
沉淀物清除 易沉淀,难清除

①载体的制备方法: 取聚合物材料加自来水调配成一定浓度,加入预先培养的菌悬 液(1:0.5~1),调匀,投入制膜装置中固化成膜状,再按需要组装成载体单元(图6-32), 装入反应器(图6-33)中,通入无菌空气进行细胞增殖,直至载体内细胞密度达109/mL (一般48h左右),即可转入发酵。

图6-32 膜状固定床载体单元

注: S=5.0mm,δ=0.5~1.0mm在保持S、δ值 不变情况下,可根据反应器大小,调整h、b值

图6-33 并流型膜状固定床生物反应器

注: V=350L 载体总体积Vc=30L

V有效=267L 载体单元数n: 7~8个/台

D:H=1:7.2 载体充填率φc=11.1%

②载体JF-3的特性

a. 比体积(v): 采用液体渗透填充法测定,取待测载体于蒸馏水中溶胀平衡,称重, 烘干,求得每克载体的吸水量,按下式计算:

式中 mL——渗透填孔液质量

m——试样质量

df——渗透填孔液相对密度

结果如表6-44。

表6-44 JF-3的vP测定值

载体浓度/(g/L) 载体干重/g 载体湿重/g vp=湿重-干重/干重/(g/g) 平均vp/(g/g)
A 0.0751

0.1551

0.2992

0.2463

0.5046

0.9790

2.28

2.25

2.27

2.27
B 0.0765

0.1535

0.3112

0.2435

0.4761

0.9795

2.18

2.10

2.15

2.14
C 0.0702

0.1526

0.2987

0.1995

0.4455

0.8545

1.84

1.92

1.86

1.87

b. 比表面(S): 采用亚甲基蓝染料吸附法测定。将定量的待测载体置于定量的亚 甲基蓝液中浸泡24h,测定溶液OD值,由预备试验测定绘制的亚甲基蓝溶液标准曲线得 出吸附质量△m,按下列计算,结果如表6-45。

式中 △m——试样吸附染料质量

A——染料分子横截面积

m——试样质量

Mr——染料相对分子质量

表6-45 JF-3比表面(S)测定值

载体浓度/(g/L) m/g △m/g S/(m2/g)
A 50×10-3 6 .5×10-3 0 .319
B 50×10-3 6 .2×10-3 0 .304
C 50×10-3 6.0×10-3 0 .294

c. 平均孔径(R)

按R=5vp/2S计算R值,结果如表6-46。

表6-46 平均孔径(R)计算值

载体浓度/(g/L) A B C
/um 17.8 17.6 15.9

d. 细胞包埋量测定: 精确取35mL载体膜(细胞计数:3.14×109/mL),溶解,离心分 离得酵母湿细胞,干燥,称重。据文献报道,每108个酵母细胞干重约0.007g,据此,35mL 载体包埋的酵母细胞干重应为,即载体细胞包埋量达 220g/L。

③发酵特性

a. 底物浓度(ρ)与反应速度(v)的关系

底物: 葡萄糖液

载体:JF-3

载体: 底物=1:10(φ=10%)

     =1:20(φ=5%)

反应时间: 1h

反应温度: 30℃

菌种: Saccharomyces Cerevisiae K

结果如图6-34所示。

图6-34 初始底物浓度对反应速度的影响

b. 产物(乙醇)对固定化酵母发酵的抑制作用: 试验条件同上,结果如图6-35 所示。

图6-35直观地表明了产物乙醇的显著抑制作用,并测得其最大乙醇耐受浓度ρm=118g/dL。

图6-35 产物(乙醇)对固定化酵母 乙醇生产速率的影响

S.Cerevisiae.“K”,JF-3,φ=10%

④发酵实例: 甘薯(地瓜)干酒精 发酵。

载体: JF-3 22.5L

反应器: 并流型固定床总容积350L, 有效容积300L

菌种:S.Cerevisiac K

底物: 甘薯干糖化液

发酵温度: 30~34℃

连续试验时间: 121d

计算方法:

0.6479——糖醇理论得率,mL/g

或L Et-OH/(m3·h)]

结果见表6-47。

表6-47 膜状载体固定化增殖酵母发酵酒精

反应器容积/L 350 流出液残总糖/(g/dL) 1.08
试验液体积/L 300 发酵时间/h 22.7
充填载体量/L 22.5 总糖利用率/% 90.73
连续试验时间/d 121 糖醇转化率/% 97.71
底物初始糖浓度(总糖)/(g/dL) 14.96 载体乙醇产率/[LEt-OH/(m3·h)] 51.19
流出液乙醇含量/%(体积分数) 8.79 糖醇得率系数 0.4997

表6-47表明,连续试验4个月,各项指标稳定,显示出其长期运转的稳定性;载体试 验规模由实验室的2.5L放大至350L,各项指标基本保持一致,显示出其良好的放大稳定 性;膜状载体的甘薯干原料糖醇转化率稳定在51.19L·Et-OH/(m3/h),已达到工业生产 的水平。与传统游离细胞发酵工艺相比,具有明显优势(见表6-48)。

表6-48 膜状载体固定化细胞与传统游离细胞发酵指标对比

  Bx/° SO/(g/dL) Sr/(g/dL) A/° P/%(体积分数) T/h PV/[LEt-OH/(m3·h)]
传统工艺 0.29 0.93 0.19 7.00 9.01 72 1.35
固定化工艺 0.34 1.04 0.31 4.81 9.22 165 5.69

注: Bx—外观糖度;SO—发酵初糖;Sr—发酵终了残糖;A—发酵醪酸度;P—发酵醪乙醇浓度;T—发酵周期; PV—容积乙醇产率。

上述结果为谢振根等人在江苏太仓酒精厂的生产性试验结果。

(2) 膜状并流固定床载体固定化增殖酵母细胞糖蜜原料的酒精发酵 谢振根等人同 时采用膜状载体和一套同向并流型填充床三级串联固定化增殖细胞反应器(V= 1050L)于江苏高淳糖酒厂进行甘蔗糖蜜酒精连续发酵,为期2个月,获得预期效果,各项 技术指标如下:

发酵周期          7.6h

反应器容积乙醇产率     10.41LEt-OH/(m3·h)

糖醇转化率         98.97%

单位载体乙醇产率      93.68LEt-OH/(m3·h)

与国内传统工艺比较,发酵周期缩短3/4,设备生产效率提高4倍。

(3)非载体固定化菌体细胞淀粉质原料酒精连续发酵 非载体固定化细胞,是利用 某些酵母或细菌具有强自身絮凝能力,在特定培养条件下形成稳定的絮凝颗粒,以此作为 细胞固定化方法,实现酒精的连续发酵。目前已知具有絮凝能力,可絮凝形成颗粒应用于 酒精的发酵的菌株有酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)变异株,粟酒裂殖酵母 (Schizosaccharomyces pombe)及葡萄汁酵母(Saccharomyces ovarum)变异株以及运动假单 胞杆菌(Zymomonas mobilis)等。我国白风武等人选育出具有强自身絮凝能力的粟酒裂 殖酵母菌株,在研究了该菌株絮凝条件和絮凝细胞颗粒特性及其生长和发酵动力学基础 上,采用流动床生物反应器,完成了从0.5m3反应器连续发酵酒精的中试规模,随后放大 至10m3反应器的工业性试验,于1998年承担年生产1万t食用酒精的工业生产装置,设 计40~50m3反应器,采用絮凝细胞连续发酵,年处理玉米原料3万t,实现非载体固定化 酵母细胞的工业应用。

①工艺特点: 淀粉质原料采用絮凝性酵母连续发酵酒精的工艺对糖液质量要求严 格,基本控制以下几点:a.发酵周期短,一般不超过10h,发酵过程的后糖化作用很弱,因 此糖化液的DE值应控制在90以上; b.糖化液要求清亮透明,不含悬浮颗粒,否则一些 悬浮粒子黏附在絮凝颗粒酵母表面会破坏其絮凝性; c.糖化液的C/N比要控制适当,以 满足絮凝颗粒酵母增殖和发酵的营养需要; d.整个发酵过程中要保持酵母有较高的酒精 发酵活力,在完全厌氧条件下,酵母活力衰退很快。为此,供氧可以显著改善发酵过程菌 体酒精发酵的活力。

表6-49表明絮凝酵母的酒精发酵活力在厌氧条件下衰减很快,第二批发酵的比生 产强度只有第一批的53.48%,而限量供氧发酵条件下能有效地阻止絮凝酵母活力的衰 减,至第五批比生产强度只降低了36.6%,而厌氧条件下已下降了73.40%。

②供氧对酒精得率和酵母活力的影响: 为保持较高的酒精得率yP/S,供氧是必需 的,但应尽量降低通气量。供氧过多,造成菌体增殖过快,降低酒精得率。图6-36、图 6-37表示连续发酵时比氧摄取速率对酒精得率和酵母活力的影响。随着比氧摄取速率 ro2的增大,发酵过程酒精的得率系数yP/S降低。一般比氧摄取速率以ro2为7μmol/(gc·h)左 右为最适宜。正常酒精发酵时菌体浓度为40g(干重)/L左右。

表6-49 不同条件下絮凝酵母酒精发酵性能比较

继代发酵批号 厌 氧 发 酵 限量供氧发酵
比生产强度/

[gEt/(L·h·gc)]

发酵能力

降低幅度/%

比生产强度/

[gEt/(L·h·gc)]

发酵能力

降低幅度/%

1 0.0546   0.0519  
2 0.0292 46.52 0.0394 24.10
3 0.0221 59.52 0.0362 30.25
4 0.0167 69.41 0.0345 35.53
5 0.0145 73.40 0.0329 36.6

图6-36 连续发酵时比氧摄取速率对 酒精得率系数的影响

图6-37 连续发酵时比氧摄取速率对 酵母活力的影响

③以淀粉糖化液为底物采用絮凝颗粒酵母连续发酵酒精的实例: 白风武等人研究 采用二级流动床反应器串平联方式进行连续发酵,即二级反应器串联,同时以一定速度分 别流加糖化液,以保持末级反应器中菌体在长期使用中保持较高发酵活力。操作条件为 通气量0.03VVM,温度(30±0.5)℃,糖化醪总糖浓度155~160g/L,还原糖浓度140~ 150g/L,玉米浆0.5%(对糖液汁),pH 5.0~5.2,糖化液流加量控制在平均稀释率0.1h-1 (相当发酵时间10h)。连续发酵30d,平均达到下列各指标:糖化液总糖浓度18%时,终 点发酵醪中酒精浓度超过10%(体积分数),反应器设备生产强度超过8.0kg/(m3·h),残 总糖和残还原糖分别为0.5%和0.2%。经检查反应器中酵母活力仍很正常。