6.3.1 产酶菌的培养方法

利用微生物生产酶制剂的培养方法不外乎液体培养和固态培养两种工艺，前者又有 液体表面培养法和液体深层通风培养法。目前工业生产上普遍采用液体深层通风培养工 艺。由于固态培养所用基质价廉、易得，对霉菌培养不损伤菌丝繁殖，近年来对固态培养 工艺和装置研究颇多，如固态法生产糖化酶、植酸酶、纤维素酶，应用于饲料工业，具有酶 活力高、成本低、提取方法简便等优点，受到欢迎。

6.3.1.1 液体表面培养(又称静置培养法)

此法系将已灭菌的培养液冷却至32～35℃，在无菌条件下接入微生物菌丝体或分生 孢子，通过定量泵输入发酵室内各培养盘上，液层一般在2.5～3.0cm，培养过程通入温、湿 度适宜的无菌空气。液体表面培养的优点是动力消耗低，培养操作简便。缺点是生产能力 低，防止杂菌污染较困难，生产占地面积大。国外在柠檬酸发酵方面，仍有少量企业采用液 体表面培养工艺。培养液液层提高至8～10cm，增设液下搅拌装置，待菌膜形成，在膜下进 行缓慢搅拌，并采用菌膜的重复利用，在培养液中代谢产物的积累达到高峰期而营养物质 已耗尽时，排出成熟的发酵液，在菌膜下通入新配置的培养液，这种方法称之为置换法。虽 然此法能提高单位面积的产率，但与液体深层通风培养法相比，在经济上仍缺乏竞争力。

6.3.1.2 液体深层通风培养

液体深层通风培养是酶制剂生产的主要方法，所用设备即为生物反应器，其结构见本 卷第七章。

酶制剂生产用的微生物多数为丝状菌、细菌和酵母菌。生物反应器以机械搅拌型为 主。近年来，各种类型的气升式反应器研制成功，对于丝状菌的培养尤为适宜，因丝状菌 繁殖过程中菌丝体受到高速搅拌所产生高剪切力的影响，易发生菌丝断裂，甚至完全破 裂，影响菌的正常生长和酶的积累。

液体深层通风培养自动控制程度高，可根据菌种性能和产酶条件进行补料批式培养 或连续流加培养，是提高酶的活力和降低生产成本的有效途径。

(1) 补料批式培养工艺 补料批式培养是介于批式培养和连续培养之间的一种培养 工艺。顾名思义，补料是向发酵罐中补加物料，但并不连续向外排出发酵液。因此，发酵 罐内的培养液的体积(V)不再是个常数，而是随时间(t)和物料流速(v)而变化的一种变 量操作。根据Mocor报道，补料技术可分为几种方式，按补入物料的组分可分完全补料 培养，即补入成分完全的培养液，部分补料培养则补入一种或几种限制性的营养成分。一 般情况下仅补充碳源或少量氮源。根据物料流入(v_in)和流出(v_ex)反应器的速率，在实 际生产上为两种操作方式，即为批发酵(v_in＝v_ex＝0)和连续发酵(v_in＝v_ex≠0)，前者代 表性工艺为间隙工艺(v_in＝0)、间隙补料工艺和连续补料工艺[v_in＝v_in(t)]，后者代表性 工艺有重复循环工艺和连续工艺(V=常数)。常用的单纯补料工艺都是增体积操作，发 酵时间一般要适当延长。若定期从发酵罐中取走一定的成熟醪，称为重复循环工艺。连 续培养是重复循环补料培养的延伸，达到补料和出罐连续进行，且速率相等，见图6-1。

图6-1 物料流速函数

①补料分批培养的物料流加方式及其控制： 在连续补料工艺中有以下三种操作 方式：

a. 恒定流速操作： 在这种操作方式中，补料速度是个定值，操作容易掌握，是目前发 酵工业生产上常用的补料方式。恒定流速操作一般在微生物的指数生长期开始补料，微 生物对底物的消耗也呈指数增加，因此发酵液中的底物浓度会逐渐降低。

b. 恒定底物浓度操作： 是指在连续补料过程中维持限制性底物浓度恒定的一种操 作。当比生长速率和底物消耗速率只是取决于这种限制性底物的浓度时，这种操作与指 数流率补料操作相同，但当产物的浓度对微生物生长产生抑制时，补料速率要随比生长速 率的变化而降低。

c. 指数流率操作是使指数生长期的培养物维持其比生长速率(μ)不变，培养基的补 加速度和培养液体积均呈指数增大。这种补料操作可在短时间内获得最大量的细胞，并 可通过变更培养基的流加速率来控制比生长速率，但流加的装置和控制系统较复杂，在生 产上实施有一定困难。

②补料分批培养的应用实例： 在微生物胞外酶的生产中，经常产生代谢产物或大分 子的降解物对酶的合成产生阻遏作用，如纤维素酶对纤维素降解的反馈抑制见图6-2。

图6-2 纤维素酶法降解生产酒精过程中代谢产物对酶的阻遏作用

图6-2清楚表明葡萄糖和酒精对纤维素酶产生菌合成纤维素酶有抑制作用，若采用 流加补料方式，把葡萄糖的浓度和酒精的浓度限制在一定水平上，也可采用连续补料或重 复循环工艺使纤维素酶活力长期保持高水平。Hendy，N·A等人试验，当分批培养里斯木 霉(Trichoderma reasei)C₃₀菌株在5%纤维素培养基中，其酶活力为8u/mL，容量产率为 55u/(L·h)，而采用补料分批培养，酶活力可达26u/mL，容量产率可超过130u/(L·h)。

(2)连续培养工艺 在工业生产中连续培养是指培养过程的操作是连续进行的，发 酵罐中菌体生长情况为：

接入的菌体+循环进入的菌体+生长形成的菌体-流出的菌体=积累的菌体

即：

式中 α——再循环的发酵液在总发酵液中的比值

C——浓度系数

F——物料流入的体积容量

V——反应器中原有培养液体积

X₀——接种时菌体浓度

t——培养时间

发酵罐中的限制性底物的情况为：

循环进入的底物-流出的底物-消耗的底物=积累的底物

即：

及

式中 X——菌体浓度

D——稀释率

y——产量常数

S₀——流入物料的最初浓度

S——物料浓度

故用连续培养方法以生产菌体为产物时，采用菌体循环操作，菌体的浓度会增大。连续培 养在工业生产上应用较普遍，如酵母生产以及微生物初级代谢产物的积累等方面。对酶 制剂来说，随着固定化酶和固定化细胞技术的发展，连续反应已在工业生产上广泛应用， 如高果糖浆生产已实现上万吨的规模。把固定化细胞和连续培养工艺结合，可更有效地 消除代谢产物的反馈抑制，如酒精生产采用批式发酵时，糖液浓度一般在10%～12%，而 采用固定化细胞连续发酵酒精的工艺，糖液浓度可提高至18%～20%。

6.3.1.3 固态培养法

固态培养是基于微生物能从不溶性的固体物质中摄取生长所需的营养物质。液体培 养时所有溶解的基质都是可以利用的，而固态培养工艺在最初阶段，基质中的大分子聚合 物不能通过细胞膜的渗透屏障，微生物不能立刻利用，因此，固体基质中的大分子聚合物 在进入细胞之前需进行转化，通常由微生物细胞产生的酶对大分子先进行降解，转化为微 生物能吸收的营养物质。在固态培养中转化速度往往是决定其生长速度的重要因素。

微生物对固体基质的利用受到多种不同物理、化学因素的影响，首先是固体物的比表 面积、多孔性和对酶的可及性，另一是聚合物的聚合度、结晶度、化学性质和酶的可降解 性。Mandels，M.等人使用经过制浆处理的云杉、木杉为基质时，纤维素水解速度和平均 孔径随处理程度即木质素含量的降低而增快。经过干燥的木浆，其平均孔径降低，从而降 低了酶对基质的可及性。对于天然纤维性材料来说，由于在不同的表面上，纤维素的结晶 度和木质素含量的差异，使酶的可降解程度也不同。

(1) 固态培养的一般特性 固态培养起源于我国酿造生产所采用的制曲技术。近年 来，在固态培养设备的研制和生产自动化、机械化方面有了新的进展。

微生物在固体基质上生长，当基质的水分含量低于12%时，细胞的生命活动能力就 丧失，故含水量12%成为固态培养能否进行的下限。固态系统含水量的上限(即游离水 开始出现时的水量)是基质吸水性的函数，随基质材料不同而异。例如槭树皮在含水量为 40%时出现游离水，而麦秸要在含水量达到75%时才出现游离水。实际上，对微生物本 身而言，直接与生命活动有关的是基质中有多少水分可以被利用，可利用的水分量一般由 水分活度(A_w)来表示，水分活度为湿固体物的水蒸气压(p)与纯水蒸气压(p₀)之比，即 此外，水分活度还与溶质的种类和数量有关。纯水的A_w为1.00。A_w值随 溶质的添加而降低，A_w值乘上100，即为与湿固体物平衡的空气相对湿度(RH)。RH (%)=100·A_w。细菌和酵母等微生物生长需要游离水，即需较高的A_w的环境。一般固 态发酵中基质含水量在55%～60%。某些丝状菌能在较低的水分活度下正常生长。因 此在固态培养时，把基质水分含量控制在仅满足丝状菌生长而低于细菌生长所需的水分 活度值，这样可做到有效地控制细菌的污染。因此，一般说，固态培养工艺的条件控制比 较粗放。

(2) 固态培养工艺和设备 固态培养在我国有着悠久的历史，许多传统的发酵产品 如酱油、白酒、黄酒等生产工艺都是以固态发酵为主。典型的固态发酵为制曲工艺，是传 统的东方发酵技术。通常采用的培养基为谷物、麸皮、豆类。在制曲过程中，麸皮和其他 原料加水拌匀，蒸煮后含水在50%～55%，pH4左右，冷却至室温后接入真菌孢子。通常 在曲房内培养，采用曲盘或帘子以及20世纪60年代发展起来的机械化通风制曲。在曲 盘或帘子培养时，培养基厚度不能太厚，一般在20～30cm。为促进空气流通，培养基中添 加15%～20%的谷糠作为疏松材料。在培养过程中，微生物边繁殖边产酶，并释放出热 量和CO₂，因此曲房的通风条件很重要，应适时地采取降温措施。机械通风制曲一般采用 强制通风，因此培养基层厚，称之为厚层通风制曲，其温、湿度可通过无菌空气加以调节。 固态发酵具有它自身的优点，特别是对于那些规模大、产值低、产品的纯度不太高的产品 如饲料用酶制剂，用纤维素废料生产的纤维素酶、植酸酶以及SCP等饲料添加剂。由于 固态培养能耗低、设备简单、投资少、产率较高，故有广泛的发展前景。目前，日本在研究 固态发酵设备，提高机械化、自动化的控制水平方面已进行大量研究。固态培养的优、缺 点见表6-1。

表6-1 固态培养的优、缺点