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9.1.6 亲和色谱

9.1.6.1 原理

随着食品工业的发展,消费者对食品功能性的要求也日益迫切。食品中功能性组分 的分离提纯和不良功能性物质(如消化抑制剂、生物毒素和农药等)的分离清除,已成为一 项很重要研究课题。比之普通的纯化分离技术,有生物专一性的纯化技术具有不可比拟 的优点。因为普通的分离方法均基于被分离组分之间的如溶解度,分子大小,形状和电荷 等物理化学性质之间的差异来实现组分分离的。亲和色谱法是在20世纪60年代末开始 发展起来的一种提纯技术,它是建立在溶液中的生物分子与固定于固体载体材料上的特 异分子(被称为配基)之间的生物专一性识别基础上的实验室分离技术,这种分离技术具 有高度的选择性和专一性,今天该项技术已经超过了分子范畴,扩展到病毒、细胞和细胞 器的分离提纯上,而且开始日益广泛地在产业规模上得到应用。

利用亲和色谱技术分离如蛋白质之 类组分的方法的原理如图9-19所示,当 含有多种组分的溶液通过装填有表面带 连接有特异结合分子(配基)的吸附剂的 色谱柱时,只有同配基具有适当亲和关 系的分子(配体)能够被吸附剂所吸附, 而其他分子则不能被吸附剂所吸附。当 吸附完成后,冲洗色谱柱以便除掉柱中 未被吸附的杂质,再用适当的解吸剂处 理配体-配基复合物使配体从配基上分 离开来。通过这样的简单的步骤,就可 以完成通常利用传统方法需要繁琐的处 理步骤才能解决的生物活性物质的分离提纯问题,而且产品纯度和收率也可明显提高。

图9-19 亲和色谱分离原理示意图

9.1.6.2 亲和吸附剂

(1) 亲和吸附剂的骨架 亲和吸附剂的骨架(或称支持体)是亲和吸附剂中用以连接 固定结合分子即配基的不溶性载体。目前所使用的骨架材料有琼脂糖、多孔玻璃或硅胶、 聚丙烯酰胺、甲基丙烯酸酯和纤维素等多种材料。理想的骨架材料应该具有如下性质(而 实际采用的骨架材料很难兼顾到所有方面): ①不溶性; ②强度; ③通透性; ④大孔性; ⑤亲水性; ⑥具有化学衍生物生成能力; ⑦非专一性吸附能力低; ⑧抗微生物和酶的降 解; ⑨价廉、易得,容易合成。

① 琼脂糖: 琼脂糖是一种甘露聚糖,是最早用于亲和色谱和一般色谱分离材料的载 体,它具有多孔性亲水结构,其结构中的众多羟基为制备衍生物提供了良好的基础,其结 构中的3,6-脱水甘露糖的单元使得其结构具有一定的抗降解性。缺点是强度较低,热 稳定性较差,价格较昂贵。

② 多孔玻璃和硅胶: 控孔玻璃是用于生物材料固定化的最常见的无机材料,玻璃材 料具有强度大,极抗降解,不同于其他材料,在介质条件改变的条件下亦无强度和体积的 变化。这种材料的两个显著的缺点是非专一性吸附程度较大,且在碱性介质条件下会有 少量物质溶出。其中的第一条缺点可以通过用葡聚糖等材料进行有机涂层处理而在相当 大程度上得到克服;溶解性问题可通过在玻璃表面涂敷如锆和钛等金属的氧化物而减轻。 而上述两类玻璃衍生物也有商品供应。

另一种比较便宜的硅酸盐材料是大孔硅胶珠,这种材料可以部分替代控孔玻璃材料 作为亲和吸附剂的骨架材料。

③ 聚丙烯酰胺: 聚丙烯酰胺是通过丙烯酰胺和二丙烯酰胺共聚制得,其主干是烃 链,侧链是酰胺。优点是在宽阔的pH环境和溶剂下保持性质稳定,没有离子化基团,生 物学稳定但强度低。

另外常使用的骨架材料是羟烷基甲基丙烯酸酯和纤维素等。

(2) 展臂结构 为了减少骨架的空间限制作用对配体与配基的结合的影响,通常在 配基与骨架之间采用基本呈线性结构的分子将两者间隔一定距离,这样配基可伸入到液 相之中,活动较为自如,能比较容易地结合配体。对展臂材料的选择一般也是要求非专一 性吸附尽量低的。从合成和减少空间阻碍上考虑,目前使用最多的展臂结构多是线性的 烃链,这样就难免会有一部分蛋白质与此结构发生非专一性的吸附作用。这种非专一性 的结合,当合成亲和吸附剂时采用首先进行展臂和骨架结合,然后再通过反应接上配基的 合成次序时,会更加严重。因为在反应后在骨架上总有部分烃的展臂未与配基连接上而 呈裸露状态,从而较容易发生以上非专一的结合作用。为了减轻上述不良作用,可将合成 次序调整为先行配基与展臂的连接,然后设法将此结合后的分子连接在骨架上。

(3) 亲和吸附剂的配基 配基是指可与固体支持物共价连接的,对目标分子有专一 和独特的亲和力的小分子。该分子在结构上应该具有可化学修饰的能力,在同固体支持 物相连接,且在修饰后不破坏或严重改变其与目标分子的相互识别能力。

酶是可用亲和色谱法分离提纯的最多的一类蛋白质,分离酶的方法有两种:用专一的 酶抑制剂或底物吸附酶;或用一类通用性配基来纯化种类更广的酶类。

对酶的分离可以使用很多种配基,这些配基包括竞争性酶抑制剂、辅酶、底物或辅助 因子等。以这样的配基合成的亲和吸附剂只是专门用于某种特殊酶的提纯。有时一种专 一性的色谱分离柱可能用来对不同来源、但可催化同一反应的多种酶的分离提纯。表 9-12是基于专一性相互作用的一些酶-配基的组合。

表9-12 用于酶的分离的专一性配基

配 基 洗脱剂 配 基 洗脱剂
N-乙酰葡萄糖胺酶 硫代-N-乙酰葡萄糖胺 NaCl 羧基肽酶N 氨基苯代精氨酸  
腺苷酸脱氨酶 肌 苷 腺苷酸 胆碱脱氢酶 胆 碱  
D-丙氨酸羧基肽酶 青霉素 NaCl,羟氨      

通用的配基是可用于较宽范围的酶的配基,因为约30%的已知酶在同底物作用时需 要辅酶的参与,而利用辅酶作为配基可以使相当数量的酶用一种分离柱进行分离。常见 的辅酶有NAD、NADP、ATP、CoA和其他一些腺嘌呤核苷衍生物。表9-13是一些可利 用通用配基进行提纯的酶。

表9-13 可利用通用配基纯化的酶种

通用配基 洗脱剂 通用配基 洗脱剂
丙氨酸脱氢酶 NADP NaCl 苏氨酸脱水酶 AMP AMP
L-阿拉伯糖激酶 ATP NaCl 磷酸葡萄糖异构酶 ATP 6-磷酸葡萄糖
胆碱乙酰转移酶 辅酶A   细胞色素还原酶 NADP、ADP NADP
异柠檬酸脱氢酶 AMP NAD 3-β-羟基固醇脱氢酶 NAD Pi
山梨醇脱氢酶 NAD NAD      

作为一类特殊的合成配基,一些多阴离子芳香性染料色体,可以用来模仿自然界生物体中 的杂合环类物质如核苷及辅酶等分子的形状、大小、电荷分布等性质,从而成为一类通用的配 基,尤其是一些三嗪系活性染料。如气巴公司的Cibacron Blue F3G-A可作为一系列酶的通用 吸附剂,这些酶包括以吡啶核苷为辅酶的氧化还原酶、磷酸激酶;以辅酶A为辅酶的酶类;水解 酶、转氨酶、聚合物酶、限制性内切型核酸酶、磷酸二酯酶等及其他的一些蛋白质。

利用合成染料做为通用型配基与固定化辅酶和其他专一性配基,在大规模亲和色谱 分离上具有五个主要的优点:

① 固定化的染料吸附剂对蛋白质结合能力比生物来源的配基材料高10~100倍;

② 合成染料可以方便地连接到骨架上而且抗化学和酶的降解作用;

③ 这些染料具有普遍的适用性,洗脱结合的蛋白质的得率高;

④ 由于染料具有特征性的颜色,故容易监测其浓度;

⑤ 价格合理、方便易得。

表9-14是常见的一些可用做亲和吸附剂的染料的牌号和性质。

表9-14 几种染料吸附剂

活性染料牌号 相对分子质量 最大吸收波长/nm 摩尔吸光率/(1/mol·cm)
Cibacron Blue F3G-A 773.5 610 13600
Procion Brown MX-5BR 588.2 530 15000
Procion Green H-4G 1760.1 675 57400
Procion Red H-8BN 801.2 546 21300
Procion Red H-E3B 522 30000

除了酶以外,可以利用亲和色谱方法分离提纯的物质可包括从小分子的肽段大到细 胞器在内很多的物质,对于很多具有专一性相互作用的分子之间都可能建立起供分离提 纯用途的配基。

(4) 配基与支持体表面的偶合过程 所谓偶合过程,就是将配基同骨架或称支持体 的固体表面通过适当的化学键相连接的化学反应过程。在选择偶合方式时,需要考虑骨 架材料和配基上存在的官能团的种类和反应性,及在化学反应条件下的稳定性。而在偶 合过程中所涉及的反应性基团主要是羟基、氨基和羧基。对于多数骨架材料如多糖、玻璃 等表面的羟基的反应性较差,所以需要经过某种反应生成反应性较强的衍生物。最常用 的是氰酸酯衍生物,这类物质是通过表面带有羟基的骨架材料同溴化氰反应制成。所得 到的氰酸酯衍生物可以在温和的条件下同配基或展臂上的氨基发生反应而连接在一起, 得到所需要的亲和吸附剂或新的衍生物。具体反应过程如图9-20:

图9-20 羟基载体的衍生物化

此外尚可使用环氧类物质、羰基咪唑和磺酰氯等进行骨架表面羟基的活性衍生物的 制备反应,利用这些反应或可直接连接展臂,或可使生成的亲和吸附剂的非专一性吸附降 低,稳定性增强。具体选择可根据具体骨架和配基性质加以确定。

9.1.6.3 亲和吸附操作

作为吸附操作过程的一种,亲和色谱操作基本上也分成静态吸附操作、柱式操作和色 谱分离操作等三种基本形式。由于亲和吸附的选择性这一性质,静态的操作流程还具有 其特色–在多组分溶液体系中,可以同时浸入多只分别装有连接不同配基的亲和吸附 剂的可通透性容器(俗称茶叶包)同时进行多组分吸附操作,这样可使复杂的生物样品中 的众多组分可以相对快捷地分别加以吸附回收而彼此各不影响。一般的批式吸附过程的 产品分离步骤为:

① 混合吸附: 将亲和吸附剂同含有配体的溶液混合,在适宜的条件下进行选择性的 吸附;

② 吸附剂分离: 采用过滤等方法将吸附平衡后的残液同吸附有配体的吸附剂颗粒 分离开;

③ 洗涤杂质: 用适宜成分的缓冲液适当地洗涤上面得到的吸附剂复合物,洗掉吸附 剂上残留的非专一性吸附的物质;

④ 配体解吸: 用适宜的解吸剂处理复合物,使吸附的配体分子从复合物上解吸下来;

⑤ 吸附剂回收: 分离吸附剂和配体溶液,使吸附剂可以重复利用,配体可以得到进 一步回收处理。

填充柱式亲和吸附装置也是大量采用的操作方式,料液通入均匀填充在亲和吸附柱 中的吸附剂层,配体和吸附剂发生专一性的亲和吸附,接着用缓冲液冲洗吸附剂层,最后 用洗脱剂进行洗脱。而色谱方法多数是在使用选择性稍差的通用性亲和吸附剂的场合, 利用亲和性的差异使用不同的洗脱条件进行二次分离。

亲和吸附剂从溶液中吸附溶质形成的配基-配体复合物具有一定的稳定性,而配体 多数是稳定性较低的生物活性物质,故洗脱通常采用比较温和的方法进行,如调整pH、改 变离子强度和温度等条件。如从高吸附亲和性的吸附剂上洗脱蛋白质可能需要如尿素或 盐酸胍等蛋白质变性剂。对高亲和力复合体的洗脱过程,理想的洗脱条件应使蛋白质的 构象发生足够的变化从而降低配基对配体的亲和力,但不能使蛋白质发生完全变性和解 折叠。洗脱后的蛋白质应该立即采用中和、稀释和渗析等方法恢复其原有的结构。

配体也可以利用选择性断开支持体–配基之间的化学键,以配体-配基复合体 的形式从吸附剂上分离下来,过量的配基可通过渗析或凝胶过滤等方法加以除去。这 种方法适用于支持体同配基通过偶氮基和硫醇酯或醇酯键相连接的亲和吸附剂的 场合。

严格地说没有通用的一种方法可以应付所有的亲和色谱的洗脱过程。然而还是有几 种适合专一性和通用型的亲和色谱的洗脱过程且效果较好。

对吸附的蛋白质可采用专一性的抑制剂或底物的溶液作为洗脱剂,它们可以与配 基的结构相同也可以有所变化,如果是相同的成分,作为洗脱剂其浓度必须足够的高 才行。

专一性的洗脱也被称为亲和洗脱色谱术,因为在洗脱过程中利用配基、haptan、溶 液中抑制剂等多种分子对配体上的结合位点的竞争,从而发生相间分配。利用吸附的 素材的生物亲和性进行洗脱是高选择性提纯的最佳条件。另一方面,当不能适用专一 性方法进行满意的洗脱操作时,也可以尝试采用非专一性的洗脱方法。非专一性洗脱 方法包括溶剂和缓冲条件的改变、pH和离子强度的改变、可逆的变性及化学断裂化学 键等。

在设计用于亲和色谱中的策略时首先考察多种非专一性的洗脱方法。非专一性洗脱 可认为是冲洗柱子的一个额外的步骤,只是该步骤可以洗掉想要获得的物质。冲洗过程 首先是用含高盐量的缓冲溶液冲洗以洗脱只是基于离子交换性质而被吸附的组分。偶尔 也适用含盐量较低的溶液冲洗以洗脱掉只是由于氢键而结合的被吸附组分,当改变离子 强度效果不明显时,改变缓冲溶液组成,如由Tris改为硼酸,可能会有所帮助。下一个步 骤是改变洗脱剂的pH,可用0.1mol/L的醋酸溶液或0.5mol/L的氨水逐渐调整酸碱度。 如果想要的成分仍不能洗下,可用丙二醇、二噁烷或丙酸进行处理以使其洗下。表9-15 是常用于蛋白质和固定化的染料亲和吸附剂分离的洗脱剂:

表9-15 亲和吸附的洗脱剂

洗 脱 剂 浓 度
非专一性的 盐 类 NaCl,KCl,CaCl2,NH4Cl,(NH4)2SO4 0.025~6mol/L
多元醇 甘油,乙二醇
chaotropes 尿素,硫氰化钠,硫氰化钾
鳌合剂 EDTA,吡啶二羧酸
洗涤剂 0.1%(w/s)SDS,Triton X-100  
专一性的 辅酶,核苷,多核苷,底物,染料等 0.001~25m mol/L

9.1.6.4 理论模型简介

假设在亲和吸附剂表面发生了专一性的吸附,由于吸附最多只能吸附一层,游离的配 体、空闲的配基和结合态的配体-配基复合物之间在亲和吸附柱内达到平衡状态,而且由 于配体和配基在吸附剂表面的吸附会在空间上影响其他位置上的吸附发生,根据以上假 设可得到有关吸附剂表面形成的复合物的浓度的表达式如下:

          (9-42)

式中 [E]–游离配体的浓度

 [B]–空闲的配基的浓度

 [Bo]–初始配基的浓度

 AE–由单位质量的配体所覆盖的吸附剂的表面积

KEB=[E][B]/[EB],称为复合体的解离常数。

相似地,当用一种洗脱剂W对配基-配体复合体进行洗脱时,W同配基没有相互作 用而与配体相互作用形成一种不与配基结合的新复合物EW,其浓度为:

          (9-43)

式中   V–各级液体的体积

 mWj,S–W洗脱剂在j级经过S步传递后的质量

 KEW=[E][W]/[EW]称为复合物EW的解离常数

最后,在j级经过S步传递后的溶液中的配体(包括E和EW形式)的分率fEj,s为:

          (9-44)

式中 AT–每一级的吸附剂的表面积

上面3个公式是分级色谱模型中推导出的公式,在该模型中,长度为L的色谱柱被分为 N个平衡级,每一平衡级的长度等于一个理论塔板高度。级中的某一部分q,从一个级传递到 下一个级中,在j级中的所有形式的配体在经过S步的传递后的质量mwj,s可由下式给出,

mwj,S=qfEj-1,S-1mWj-1,S-1+(1-qfEj,S-1)mwj,S-1           (9-45)

同样

mWj,S=qmwj-1,S-1+(1-q)mwj,S-1           (9-45a)

最后

mWj,S=[E]V+[EW]V+[EB]AT           (9-45b)

根据以上的公式,从进口开始可以逐级计算出各级的洗脱情况。图9-21是采用不 同解离常数的洗脱剂洗脱过程的情况。

图9-21 对中等结合系数(Ki=10-4mol/L)之亲和吸附柱采用不同洗脱剂的洗脱过程的模拟曲线

[例] 利用亲和色谱分离回收重组大肠杆菌生产人类白细胞介素,提取过程如下:

通过以上的简单的分离操作,生物样品中极微量的生物活性分子得到了极大的富集 和提纯,而且回收率相当高(见表9-16)。

表9-16 各分离步骤对抗体的回收情况

步 骤 体积/mL 总蛋白质量/mg 总活力/u 比活力/(u/mg蛋白质) 纯化系数 回收率/%
硫酸铵沉淀 700 37100 7.4×109 2.0×105 1.0 100
抗体柱亲和色谱分离 27 30 7.0×109 2.3×108 1150 95
CM 52 30 20 6.0×109 3.0×108 1500 81