水产百科

一、粗蛋白质的测定

最近更新:2023-02-14

凯氏微量定氮法(一) 原理

含氮有机物与浓H2SO4共热而被分解(消化),一部分有机物 成挥发性物质而逸去,但全部的氮却以氨的形式游离出来,与 H2SO4结合而成(NH4)2SO4,加入NaOH溶液后放出氨,由硼酸 溶液吸收,再用0.1mol/LHCl滴定即可算出样品中的氮量,由氮 量乘以蛋白质换算系数 (6.25) 就可得出样品的蛋白质含量。

此反应进行缓慢,通常加入CuSO4作催化剂,并加入K2SO4 以升高溶液的沸点。

2NH3+4H3BO3→(NH4)2B4O7+5H2O

(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O→2NH4Cl+4H3BO3

由于样品中的氮素除了来自蛋白质以外,还有少部分来自氨 基酸、铵盐和硝酸盐等,最后都被H2SO4吸收变成 (NH4)2SO4, 因此测出的蛋白质称粗蛋白质。

(二) 仪器

凯氏微量定氮装置。

(三) 试剂

(1) 33%NaOH溶液。

(2) 0.1mol/L HCl标准溶液。

(3) 0.1%甲基红—次甲基蓝指示剂。

(4) 2%H3BO3溶液。

(四) 操作步骤

(1)样品消化 精密称取样品0.2g左右于50ml凯氏烧瓶中, 加消化剂1g (CuSO4—K2SO4混合粉末1:4)、浓H2SO42ml及 1~2颗玻璃珠,混匀后斜放在消化架上,用微火加热,待将水分 驱尽后,白烟自管口逸出,这时即可加大火焰至溶液呈浅绿色透 明为止。待溶液冷后移入100ml容量瓶中,并以蒸馏水洗涤凯氏 烧瓶数次,将洗液一并倒入容量瓶中,最后以蒸馏水稀释至刻度, 混匀备用。

(2) 样品蒸馏 在三角烧瓶中加2%H3BO310ml及0.1%甲 基红—次甲基蓝指示剂2滴,置冷凝管下端,使管口浸于H3BO3 液中。准确量取消化液10ml经漏斗流入蒸馏器内,再用5ml蒸馏 水洗涤漏斗,洗涤水也流入蒸馏器中,加入33%NaOH溶液10ml, 蒸馏3min。将三角烧瓶放下,使冷凝管尖端高出液面约1cm,继 续蒸馏1min,用蒸馏水约3ml洗涤冷凝管尖端,并使洗涤水流入 三角烧瓶中。用0.1mol/LHCl标准液滴定,另作一空白试验。

图4-1-4 凯氏微量定氮仪

A—烧瓶 B—排液管 C—蒸馏器 D—长管 E—导管

F—定氮球 G—冷凝管 H—吸收瓶 I—加液漏斗

(五) 计算

式中 c——HCl标准液的浓度 (mol/L)

V1——样品滴定时消耗HCl标准液的量 (ml)

V2——空白滴定消耗HCl标准液的量 (ml)

0.014——每摩尔氮的质量 (g)

6.25——蛋白质换算系数(蛋白质的含氮量平均以16%计算)

m——样品质量 (g)

[附]纯蛋白质的测定

(一) 原理

用氢氧化铜使纯蛋白质沉淀为不溶物,过滤以使蛋白质和溶 解的非蛋白质分离,然后作氮素的定量,乘以6.25即纯蛋白质的 量。

(二) 操作步骤

精密称取1g左右经充分研碎的样品于200ml烧杯中,加蒸馏 水100ml煮沸,加含氧化铜约0.3~0.4g的氢氧化铜溶液,振荡, 蛋白质全部沉淀,冷却后过滤,以冷水充分洗涤沉淀,直至洗液 不再呈SO42+反应(用氯化钡试验)为止。然后将滤纸连同沉淀一 起置烘箱中干燥,再放入凯氏烧瓶中,按凯氏微量法进行氮素的 定量。另用不带沉淀的滤纸进行空白试验,纯蛋白质含量百分比 计算同粗蛋白质测定法。