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微藻培养

microalgae culture经济海产动物育苗中植物性微小饵料生物的人工生产方法。微藻的藻体由单细胞或多细胞组成,是最简单的低等微观藻类,大多营浮游生活。是自然水域中的初级生产者。

简史 1910年,英国艾伦(E.J.Allen)和纳尔逊(E.W.Nelson)开始了海洋硅藻类的培养,首先将这些藻类用作海产动物幼体的饵料。1938年英国帕克(MW.Parke)在英国普利茅斯取样分离出绿光等鞭金藻(Isochrysis galbana Parke),被认为是海产贝类、甲壳类等经济动物幼体的优良饵料。20世纪40年代,苏联、美国、德国等国为寻觅代食品和代饲料,进行了微藻的大量培养研究。60年代以来, 由于海产动物苗种的企业化生产,饵料微藻的大规模培养获得迅速发展。中国的微藻培养研究的创始人朱树屏于1942年就海洋浮游植物的培养液及培养方法进行了深入研究,创制了多种培养液。至80年代末各国在鱼类、甲壳类、贝类育苗和浮游动物培养中应用的微藻饵料已达30种以上。

生态条件 主要种类的生态条件见表1。形态特征 主要种类的形态特征见表2。

表1 微 藻 主 要 种 类 的 生 态 条 件

生态条件 种 类 温度(℃) 盐度(‰) 光照度(×103lx) pH
适 宜 最 适 适 宜 最 适 适 宜 最 适 适 宜 最 适
亚心形扁藻 青岛大扁藻 7~30 10~35 20~28 25~28 8~80 9~61 30~40 18~30 1~20 5~10 6~9 6.5~8.2 7.5~8.5
蛋白核小球藻 10~36 ≒25 5~45 20~30   ≒100 6~8  
三角褐指藻 牟勒氏角刺藻 骨条藻 5~25 15~35 8~32 ≒15 25~30 20~25 9~92 2.6~44 5~50 25~32 13~18 25~30 1~8 0.5~25 3~5 10~15 7~10 6.4~9.5 7.5~8.5 8.0~8.9 7.5~8.5
绿光等鞭金藻 湛江叉鞭金藻 15~35 9~35 20~30 25~32 15~40 6.5~52 ≒30 20~33 2~10 1~30 6~10 7~10 7~9 7~9 ≒8 7.5~8.5

培养方法 无论是室内和室外的单细胞藻类培养,其培养方式分为封闭式培养和开放式培养两种基本类型。封闭式培养是把培养藻液密封在透明容器中,与外界空气隔离。培养容器用有机玻璃或透光聚乙烯塑料,制成管状、筒状或槽状。用自然光源或电光源培养,人工供给CO2,借水泵使培养藻液不断回旋流动。可连续培养也可半连续培养。开放式培养是把藻类置开敞容器中培养,如水泥池、白瓷砖池、玻璃钢或塑料水槽。CO2由人工供给或与大气自然交换取得,也可辅以机械搅拌促使空气中的CO2溶解。有三种形式:①开放式循环系统。藻液借循环水泵不断地循环流动,并导入CO2。②开放式通气系统。通过导管定时送入CO2和空气,借以搅动藻液。③开放式不充气系统。仅对藻液定期搅拌,用以补充CO2。具体培养方法及步骤为:

藻种准备 从自然海区、海岸水洼、存贮海水的容器以及大型藻类或其他附着物上采样。经显微镜检查, 如发现需分离的藻类数量较多, 可立即分离出单个细胞或一个群体;若数量很少,难以分离, 则先进行预备培养,待藻类繁殖,形成优势种时再行分离。常用的微藻单种分离方法有微吸管分离法、水滴分离法、稀释分离法和平板分离法。选取活力强、生长旺盛的单种作为藻种,适时将藻种移入新鲜的灭菌培养液中,逐步扩大培养。中继培养在水族箱或玻璃钢水槽中进行,其高密度藻液可用作大量培养时的藻种。在整个培养期间,必须有一定数量的藻种储备,供随时取用。藻种应及时进行继代培养,以维持正常的生长繁殖。

容器消毒 将待用容器、工具用200~300毫克/升的漂白粉或次氯酸钠水溶液浸泡半小时,再用消毒水冲洗干净。大型容器和池子的消毒,可用1000毫克/升以上的高浓度漂白粉或次氯酸钠涂刷容器(池)底和壁部,半小时后用消毒水冲刷干净。大中型培养也可用5毫克/升高锰酸钾水溶液浸泡洗净的容器和工具,5分钟后用消毒水冲洗干净。或用高锰酸钾溶液淋洒几遍池底、池壁,再用消毒水冲洗干净。还可配成3%~5%的石炭酸溶液,把已洗净的池子、用具浸泡半小时, 再用消毒水冲洗干净。

表2 微 藻 主 要 种 类 的 形 态 特 征

形态特征 种类 形 状 大小(μm) 细 胞 壁
绿 藻 门 亚心形扁藻 [Platymonas subcordiformis (Wille) Hazen] 扁平、 长圆形或广卵形 长: 11~14 宽: 7~9 厚: 3.5~5 纤维质
青岛大扁藻 (Platymonas helgolandica Kylin) 扁平、 长圆形或广卵形 长: 20~24 宽: 12~15 厚: 7~10 纤维质
蛋白核小球藻 (Chlorella pyrenoidosa Chick) 球形或广椭圆形 直径: 3~5 光滑
硅 藻 门 三角褐指藻 (Phaeodactylum tricornutum Bohl.) 梭形 三出放射形 卵形 长: 14~23, 宽: 2.3~3.5 长: 10~18, 各臂长6~8 长: 8, 宽: 3 梭形细胞和三出放射形细 胞, 没有硅质
牟勒氏角刺藻 (Chaetoceros muelleri Lemm.) 壳面: 椭圆、圆形 壳环面: 长方形、 四角形 宽: 5~9.8 高: 4.2~5.6
骨条藻 [Skeletonema costatus (Grev.) Cl.] 透镜形或圆柱形 直径: 6~7 硅质少
金 藻 门 绿光等鞭金藻 (Isochrysis galbana Parke) 椭圆形或长椭圆形 长: 5~6 宽:2~4 厚: 2.5~3
湛江叉鞭金藻 (Dicrateria zhanjiangensis Hu. nov.sp.) 球形或近卵形 直径: 5~7
形态特征 种 类 鞭毛、 角毛 色 素 体 眼 点 其 他
绿 藻 门 亚心形扁藻 [Platymonas subcordiformis (Wille) Hazen] 4条等长鞭毛自细胞 前端伸出, 为体长 的3/4 1个, 绿色杯状 1个 有一杯状蛋白核
青岛大扁藻 (Platymonas helgolandica Kylin) 4条等长鞭毛自细胞 前端伸出, 为体长 的3/4 1个, 绿色杯状 1个或多个 有一杯状蛋白核
蛋白核小球藻 (Chlorella pyrenoidosa Chick) 1个, 绿色杯状 有一球状蛋白核
硅 藻 门 三角褐指藻 (Phaeodactylum tricornutum Bohl.) 梭形细胞: 1~2片, 黄 褐色。 三出放射形细 胞: 1~3片, 黄褐色 三种形态, 随具体环 境条件可转变
牟勒氏角刺藻 (Chaetoceros muelleri Lemm.) 4条角毛自细胞角伸 出, 长20~35微米 1个, 黄褐色片状 大多呈单个细胞, 偶 见2~4个细胞相连
骨条藻 [Skeletonema costatus (Grev.) C1.] 1~10个,通常2个, 黄 褐色 壳缘着生一圈细刺,与 邻近细胞的对应刺 相接, 组成直长链
金 藻 门 绿光等鞭金藻 (Isochrysis galbana Parke) 2条等长鞭毛自细胞 前端伸出, 为体长 的1~1.5倍 2个,金黄色,大而伸长, 侧生 1个 孢囊直径5~6微米, 具白糖素
湛江叉鞭金藻 (Dicrateria zhanjiangensis Hu. nov.sp.) 2条等长鞭毛自细胞 前端伸出, 与细胞 直径等长或略长 1个,黄褐色周生, 叶状 具1个(偶有2个)白 糖素

培养液制备 供培养用的海水在消毒前须经过滤。海水的消毒有煮沸、过滤、化学处理和紫外线灭菌等几种方法。较简便的是在海水注入口包扎夹有脱脂棉的密筛绢进行过滤。若采用一定压力下通过孔径极小的滤器, 则清除敌害生物更为彻底。也可用15~20毫克/升有效氯的漂白粉或漂白精进行消毒,待漂白粉气味消失后再施肥接种培养。或用含氯量为15~20毫克/升的次氯酸钠处理海水, 充气搅拌水体,8小时后再加入15~20毫克/升硫代硫酸钠去氯,半小时后即可使用。池子培养水深以10~30厘米为宜。根据培养对象的营养要求,施以理想的肥料。常用的培养液是以氮、磷、铁营养元素为主,加上微量元素、辅助生长有机物质或上壤(海泥)浸出液。常用量为氮20~40毫克/升,磷1~4毫克/升,铁0.1~0.4毫克/升。如培养硅藻,需加入2~15毫克/升的硅元素;培养金藻,需添加少量维生素B1和B12。还可加入螯合剂EDTA盐,以防铁和微量金属元素的沉淀和溶胶化。国际上常采用吉勒德(R.R.L.Guillard)和拉瑟(H. Ryther,1962)“f/2”培养液。中国常用无机肥和有机肥(人尿或贝汤等)混合培养液或人尿培养液(在处理过的自然海水中加入3‰~5‰鲜入尿和适量海泥浸出液)。施肥时应将各种肥料溶化后单独投入,投入前不宜混合。

接种 选取上浮、优质,并具一定密度的藻种(扁藻30万~40万细胞/毫升,三角褐指藻300万细胞/毫升,牟勒氏角刺藻150万~200万细胞/毫升,湛江叉鞭金藻250万细胞/毫升),弃去底部沉淀的藻类细胞。接种量以微显藻体颜色为宜,一般藻种量与培养液量的比例为1:2~1:5,在气温高、敌害生物容易出现的季节,宜用1:1或1:2的高比例接种: 加大接种量既能抑制污染生物的繁殖, 又可缩短培养周期, 目的在于短期快速形成优势种群。如藻种不足, 可分次逐级加入培养液。接种工作宜在上午8~10时进行。

培养管理 用开放式不充气方法培养,应经常搅拌藻液(每天搅动数次,每次1~5分钟),根据培养藻类对温度、光强、盐度和酸碱度的要求,尽量调节各因子在合适的范围内。每日定时观察并配合显微镜检查,以掌握培养藻类的生长繁殖情况(如藻液颜色、藻细胞运动情况、是否有沉淀附壁现象、有无敌害生物的污染等),并据以确定施肥量。一般每隔1~2日施肥一次(或添加新鲜培养液),直至完成一个培养周期。保持培养藻类的生长优势和数量优势是防止敌害生物孳生的主要措施。当培养藻类繁殖到相当密度时, 可收获一定量浓藻液直接用于投饵,并补充同量新培养液,继续培养。

采收 当藻类细胞培养到一定密度,其生长繁殖速度开始减缓,便可进行采收。将藻液搅匀后取出总量的1/3~2/3,用离心机分离,取出浓缩藻液;或在浓缩容器中加沉淀剂(0.01%~0.03%的明矾或3%~6%的饱和石灰水),混合均匀后静置2~6小时,待藻体全部沉淀后,吸出上层清液,收集底部藻类沉淀物,再用离心机浓缩或用棉布包裹加压过滤成稠密的藻浆。藻浆可直接用作饵料,亦可冰冻贮存或制成干粉备用。