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蓝藻培养

bluegreen algae culture一种最原始藻类的人工培养方法。蓝藻又称蓝绿藻,属原核细胞型生物。藻体为单细胞的群体以及多细胞的丝状体。蓝藻具极强的适应性,分布很广,有很大开发利用前途。70年代已人工大量培养的有可为水稻等农作物提供氮肥肥源的固氮蓝藻及用作饲料、食品和医药原料的螺旋藻。

固氮蓝藻的培养 固氮蓝藻指具有明显固氮能力的蓝藻。它通过固氮酶的作用将大气中游离的分子态氮转化为可供植物吸收和利用的化合态氮。用作水稻等农作物的氮肥源,能增加土壤肥力,达到增产效果。现在已知能够固氮的蓝藻达20多属,150余种,中国已报道的固氮蓝藻有70余种。在科研、生产上应用的藻种主要是鱼腥藻(Anabaena)、念珠藻(Nostoc)、单歧藻(Tolypothrix)。

据记载,早在1889年,德国弗兰克(B.Frank)就发现在光照条件下生长蓝藻的土壤含氮化合物较高。直到1928年德国德鲁斯(K.Drewes)通过纯培养才正式确认点形念珠藻〔Nostoc punctiforme(Kutz.)Hariot〕具有固氮能力。1973年英国斯特沃特(W.D.P.Stewart)在《蓝绿藻的生物学》一书中记载了120余种。中国藻类学家李良庆在20世纪30年代报道过若干省的固氮蓝藻。从50年代后期起,黎尚豪发表了一系列有关固氮蓝藻的文章,70年代后期进行了固氮蓝藻的应用研究,在稻田大面积放养固氮蓝藻,获得增产效果。

形态特征 主要种类的形态特征为:

鱼腥藻属(Anabaena Bory) 属藻殖段纲(Hormo-gonophyceae)、念珠藻目(Nostocales)、念珠藻科(Nos-tocaceae)。藻体为单一丝体,或为不定形胶质块或平展成膜状体。藻丝宽度一致或末端略细,直或略弯曲。体外具一层透明而水化的胶质鞘。细胞常为球形或桶形。

念珠藻属(Nostoc Vauch.) 属藻殖段纲、念珠藻目、念珠藻科。藻体为有一定形状的胶状群体。丝体螺旋形弯曲或缠绕,胶鞘明显或相互融合。藻丝呈念珠状,由相同形状细胞组成。细胞扁球形、球形、桶形、腰鼓形或圆柱形。

单歧藻属(Tolypothrix Kutz.) 属藻殖段纲、念珠藻目、伪枝藻科 (Scytonemataceae)。藻体为具伪枝的丝状体。胶鞘坚固,薄或厚,均匀或具层理,每条鞘内具1条藻丝。枝多为单出,偶有双出。

生态条件 固氮蓝藻为喜温性植物,适宜温度为25~35℃。在室内培养条件下,光照强度与藻体生长成正比; 水温32℃时光饱和值30 000勒。相对湿度以70%~90%,pH值7~8为宜。培养液中需添加磷、钾、钙、镁、铁、钼等元素。多数固氮蓝藻生活在淡水,海洋中种类较少。束毛藻属(Trichodesmium Ehr.)、聚球藻属(Synechococcus Nag.)等是分布在海洋的种类,还有土壤蓝藻和胞内共生蓝藻(entocyanoses),如念珠藻属。

培养方法 主要有以下几个步骤。

玻瓶藻种培养 培养容器用500~1000毫升的三角烧瓶或广口罐头瓶等,内盛1/4~1/3的水生111号或105号无氮培养液,瓶口包扎4层纱布或2层粗滤纸,经高压蒸汽灭菌,用无菌操作将琼胶斜面藻种(处于指数生长后期)接入瓶内,接种时将藻块尽量打碎离散。接种后可先暴露在阳光处照射,促使藻体迅速上浮水面,然后将培养瓶移至适宜的环境条件下培养,使蓝藻尽快进入正常生长。

浅盘培养 用白色搪瓷盘、塑料盒或瓦盆,内盛3~6厘米深无氮培养液; 配制培养液的用水,为经棉花柱过滤后的自来水或清洁的河水,也可将水煮沸冷却后使用。培养液配方: 取土壤浸出液 (土壤500克,加水1升,充分搅拌,然后静置1~2日,取上层清液),加水4倍稀释,加入1%~2%的草木灰浸出液(500克草木灰,加水1升)及1%~2%的过磷酸钙饱和液。所用藻种先集中在一个洁净的容器内,搅拌粉碎后均匀接种于盘内,接种量以藻体浮起后能占水面约1/4为宜。盘上罩塑料薄膜,以保证盘内湿度并避免外界污染。气温低的季节可在覆盖的塑料薄膜上方用日光灯加温;夏季阳光过于强烈,可选用浅蓝色薄膜覆盖,以利蓝藻生长。将适量CO2(或将CO2与空气混合)通入培养液内,可加速蓝藻繁殖。

土池培养 包括: ①建池。建池的选点原则是水源洁净(不含有大量杂藻、原生动物、昆虫和油污等化学毒物)、排灌方便、光照充足、便于管理、土壤通透性和保水性较好的地块。容积以长5~7米、宽1米、深15~20厘米为宜。池底要尽量平整,土池上方需搭拱棚,覆盖塑料薄膜; 拱棚顶高离水面40~50厘米,用以增温、增湿、防风避雨。土池四周需设排灌沟。任选泥土或塑料薄膜垫覆池底。养藻的水层一般为10厘米,可调节水深,原则上是浅水放藻,深水采收; 气温高时用深水,气温低时用浅水。

②施肥与接种。培养蓝藻的土池如选在农田,因耕作土壤本身富有较全面的营养元素,只需施入少量磷钾肥。中性偏酸的土壤宜施钙镁磷肥,约150千克/公顷,氯化钾22.5~37.5千克/公顷或草木灰150千克/公顷,也可将过磷酸钙与草木灰配合施用,用量各为150千克/公顷。采用塑料薄膜垫底的池子,池内除施用过磷酸钙外,尚需增施一些铁、钼等微量元素。藻种应是纯而健壮的鲜藻或干藻粉。在晴天的上午接种。接种量一般为100~150克/米2,若气候条件适宜,可适当加大接种量,多放藻种,勤分养,以加速繁殖。采用鲜藻接种时,应将藻体搅拌,均匀泼洒水面; 采用干粉藻种,以5~10克/米2为度,将其轻撒水面,接种后盖好薄膜,高温高湿环境利于藻粉复苏生长。

③培养管理。盛夏烈日,温度过高,中午前后应在拱棚上铺盖苇帘,或在拱棚塑料薄膜上泼洒稀泥浆水,还可揭开塑料棚的一端或两端通风,也可以向池内添加适量冷水,促使降温(40℃以下)。当藻体长满水面(藻的指数生长后期,生活力旺盛时)或虽未长满水面,但藻体因其他原因而老化、未见新藻丝铺展时,则应及时分养或采收。培养中应防治病、虫和防止杂藻的发生。摇蚊幼虫、原生动物、轮虫、蝌蚪、椎实螺以及各种杂藻等对藻体繁殖有严重危害。防治方法是首先应在水源、土壤和藻种等三方面严格把关,防止将虫卵、杂藻等带入土池。在放藻前3~5天按每公顷22.5千克施入“1605”混合粉,进行田面处理,可以减少虫的危害。为避免污水流入池内,平时尤其是夜晚要盖严塑料薄膜。青蛙卵块要随时捞出; 蝌蚪和摇蚊幼虫,则需在晴天的中午,捞出蓝藻,排干池水,盖严薄膜,使在烈日曝晒下致死,或用敌百虫、五氯酚钠等化学农药杀死。杂藻污染严重时,只有彻底清池,铲去池底表土或洗刷干净垫底的塑料薄膜,然后重新加水放养。

螺旋藻的培养 螺旋藻属蓝藻门(Cyanophyta)、蓝藻纲(Cyanophyceae)、颤藻目(Oscillatoriales)〔又称段殖体藻目(Hormogonales)、颤藻科(Oscillatoriaceae)、螺旋藻属(Spirulina)。本属约有30多种,常用种类为钝顶螺旋藻〔Spirulina platensis (Nordst.) Geitler〕和极大螺旋藻(Spirulina maxima Setch. etGardn.)。

螺旋藻的蛋白质含量很高(58.5%~71%),且具有合理的氨基酸组成,细胞壁非纤维素质,易被人类和动物消化吸收。据报道,其蛋白质真消化率高达75%;生物学值达68%; 光能转化率高达18%; 干藻产量可达25吨/公顷·年,合每公顷年产24 975千克(按蛋白质含量60%计,折收蛋白质近1000千克)。

非洲乍得湖当地居民自古就食用螺旋藻。60年代引种研究利用以来,引起了国际上生物学家和生物技术开发商的广泛重视。墨西哥建立了世界上第一个生产螺旋藻的工厂,年产干粉约450吨,用作饲料和保健食品。至80年代末,已有德国、印度、意大利、美国、法国、日本、以色列和中国等从事螺旋藻的开发研究和生产,取得了经济实效。法国、中国等进行了海水培养螺旋藻的试验研究,并将螺旋藻(鲜藻或干品)用作鱼、虾、贝的饵料,效果明显。

形态特征 单细胞或多细胞组成丝体,无鞘;圆柱形,呈疏松或紧密的有规则的螺旋状弯曲。细胞或藻丝顶部常不尖细,横壁常不明显,不收缢或收缢,顶细胞圆形,外壁不增厚。细胞内含物均一或有颗粒,藻体淡蓝绿色。

生态条件 螺旋藻在海洋及湖泊均能成活,高盐高碱水域中生长更为旺盛。适宜温度为30~35℃。最佳光照度为25 000~35 000勒,生长繁殖初期要求光照较弱。pH值以8.5~10.5为宜。需要较高的碱性环境和较高浓度的CO2

培养方法 螺旋藻的批量培养方式有两种:①洁净制式。利用新鲜、清洁的淡水,添加各种化学盐类,进行培养或生产。其产品主要用作食品、饲料或医药原料。②废水制式。以污物或污水作为螺旋藻生长的主要物质。收获的产品一般只作饲料和饵料用。但废水所含污染物必须在允许的范围以内,以防通过食物链转入人体。

藻种的保存和培养 藻种可用固体或液体CFTRI培养基(印度中央食品工艺研究所配制的一种用于螺旋藻的简化培养基)保存。接种藻丝后置于通常光照下培养,每隔30~40天作一次继代培养。当藻体生长繁殖到一定密度、水体呈深青色时,即可稀释至大玻璃瓶内进行二级扩大培养。国际上对螺旋藻的实验室培养,常用扎劳克氏(Zarrouk)培养基。

露天大量培养 可用塑料薄膜制作的培养槽也可挖土池,池底铺塑料薄膜;或用砖与水泥衬砌。池深约40~50厘米,培养水深以20~25厘米为宜。CFTRI培养基或简化CFTRI培养基均可使用,还可使用农家肥替代部分化学制品作营养成分(添加1%人尿或牛尿、牛粪灰与经蒸煮过的骨粉,可减少硝酸盐、磷酸盐和钙元素的用量)。收获藻体后的培养液可供继续重复培养使用,仅需补充被消耗掉的营养物。这种部分添加的办法可持续4~5个培养周期(亦即收获3~4次)。碳源供给有以下三种:①碳酸氢钠,最低需要量为4.5克/升(标准培养基内为16.8克/升)。②二氧化碳,通入含1.5%CO2的混合气体。③利用好气性微生物的分解作用(即好气性发酵),从新鲜牛粪和农家堆肥中制取CO2,可使空气中CO2比率得到提高。最初接种浓度以225~250毫克/升为妥。开始移到室外培养时,接种藻种的工作宜在夜间进行,以免光强突然变化,影响藻类生长繁殖。搅拌可用手工搅动或采用机械摇动,一般每天搅动2次,每次15分钟。在培养过程中,因蒸发作用造成的培养水损失,必须适当补充。补液时间宜在清晨或傍晚,并注意保持培养水的pH值。