水产百科

二、核酸杂交技术

2023-02-09

核酸杂交技术是将DNA或RNA片段用放射性同位素或光敏生物素等标记后制成的探针与病原生物的DNA或RNA杂交,以此来确定病原携带者和传播者的一类分子生物学技术。该技术以其灵敏度高,特异性强,检验快速和使用方便等优点,近年来在对虾病毒的检测中倍受青睐。

核酸杂交技术的关键是制作探针。核酸探针是指与目的基因互补配对的一段DNA或RNA探针。这些探针可从基因组中克隆获得,也可人工合成,因此,可将核酸探针根据它们的来源和性质分为基因组DNA探针、cDNA探针、RNA探针以及人工合成的寡聚核苷酸探针等几种。由于对贝类和虾类病原体的遗传背景了解较少,因此要制备某种病原体的探针,往往要用该种特有的序列组成的克隆基因组DNA片段。因此,纯化病原体是DNA克隆的基本条件。病原体纯化后可制备足量的DNA,并形成成千上万的重组克隆,随后利用凝胶电泳确定插入片段的大小,每个重组克隆就可建成一个单一探针供应源。探针的特异性和灵敏性一般取决于其大小与核苷酸顺序,另外也取决于标记方法。在水产养殖中一般采用非放射性标记,以便推广应用。但常用的还是人工合成的探针。一旦得到病原体的序列,就可在实验室合成特异性很强的探针,而且可对寡核苷酸进行直接标记。目前由于愈来愈多的病原体的序列已被测定,因此就有可能从这些序列中筛选出共同的保守序列,然后合成某种广谱特异探针,供实际检测之用,而不受能否得到病原体的限制。应用这种方法目前已对贝类和虾类中的一些病毒进行检测,因为这些病毒的已知序列在从昆虫病毒到脊椎动物病毒中都表现出共同的相似性。

探针制备好以后,便可用于以核酸杂交为基础的检测,如Southern杂交 (Southern hybridization) 和Northern杂交 (Northern hybridization)。Southern杂交技术用于鉴定和检测特定的DNA序列,是动植物基因工程中常用的技术。其基本原理是: 利用毛细作用或电泳转移方式将在琼脂糖凝胶中已经分离开的DNA片段转移到支持物硝酸纤维素膜或尼龙膜的对应位置,然后用经32P标记的DNA或RNA探针与固定在膜上的DNA进行分子杂交,并通过放射自显影确定所有与放射性探针杂交的同源片段。该技术灵敏度很高,通常只需总DNA量约10μg即可进行检测。Northern杂交则用于鉴定和检测特定的RNA序列,其基本原理类似于Southern杂交,即提取RNA样品,琼脂糖凝胶电泳,膜转移,与探针杂交,放射自显影后便可用于检测。由于核酸分子杂交过程是高度特异的,只有具有一定同源性的两条核酸单链在一定条件下可按碱基互补的原则形成杂交双链,因此应用核酸杂交技术进行诊断非常灵敏和精确。

利用核酸杂交技术进行水产养殖病原体检测的实例,国内外均有报道。Futo等 (1992) 和Hiney等(1992) 将此技术用来诊断细菌性鱼病。日本有人用异羟基洋地黄毒甙配基标记的DNA探针进行菌落杂交用于鳗弧菌的鉴定。也有人用RNA探针来研究鱼encephalitis病毒 (FEV) 在海洋鱼类中的表达模式 (Comps等,1996)。我国的水产科研人员针对1993年以来我国养殖对虾大规模死亡的病原——皮下及造血组织坏死杆状病毒 (HHNBV),研制出核酸探针,用于检测受HHNBV感染的对虾,并取得较好的效果。斑节对虾(Penaeus monodon Fabricius) 病毒 (MBV) 也可用此法进行检测。另外日本有人 (1995) 用经PCR合成的与神经坏死病病毒DNA互补的探针进行杂交选择亲鱼,可有效防止病毒性神经坏死症 (VNN) 的垂直感染。

除以上Southern杂交和Northern杂交检测技术外,目前常用的核酸杂交技术还有原位杂交 (in situ hy-bridization) 技术 (Phillips等,1996)。原位杂交是用放射性或非放射性标记的已知序列DNA或RNA探针,在细胞或染色体上与互补的核酸序列杂交,再经放射自显影或免疫荧光、化学发光在杂交原位上显示杂交体的技术。该技术可分为四个步骤: 细胞或染色体样品制备,探针的制备与标记,原位杂交反应以及杂交结果的显示与分析。目前,原位杂交已成为简单、快速检测细胞感染,尤其是病毒感染的手段。而且如果结合PCR技术,则原位杂交技术可更广泛地应用于水产动植物病原体的检测。