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二、藻类基因工程定义

2023-02-09

藻类基因工程亦称藻类遗传工程或藻类重组DNA技术,是以海藻为研究对象将某种生物基因通过基因载体或其他手段运送到海藻活细胞中,并使之增殖(克隆) 和行使正常功能 (表达),从而创造出藻类新品种的遗传学技术。通过藻类基因工程的研究,我们一方面期望从改造的藻体中筛选出抗性强且生长快的优良藻种,以及把藻类作为新型的生物反应器 (bio-reactor),生产某种特殊的有用物质。另一方面期望从藻类中分离、克隆有重要经济价值的基因,作为农作物改良的目的基因或用于微生物发酵生产。藻类基因工程作为基因工程的一个分支,相应地包括以下几个主要步骤:

获得带有目的基因的DNA片断 用限制性内切酶切割生物染色体DNA,得到大小不同的DNA片段,其中的某一片段上可能刚好有所需要的目的基因; mRNA为模板,用反转录酶 (reverse transcriptase) 进行反转录合成互补DNA,即cDNA,克隆后构建成cDNA文库,再通过一定的方法,找到目的基因所在的cDNA克隆,并以此为探针,从真核生物基因文库中钓取理想基因; 根据已知序列,用化学合成法直接合成某个基因。

重组DNA分子的构建 一般将带有目的基因的DNA片段连接到能够独立复制并具有选择标记的载体上,如质粒、噬菌体和病毒等,以形成重组DNA分子。DNA片段与载体的连接方式主要有同聚末端连接、黏性末端连接、平齐末端连接及人工接头分子连接。

重组DNA分子的转化及扩增 重组DNA (recombinant DNA) 必须进入宿主细胞DNA中,才能得到扩增和表达。根据载体的性质不同,可采用转染、转化、转导等方式,将重组DNA分子导入宿主细胞内,并使其大量繁殖。

对重组克隆 (recombinant clone)进行筛选 在转化实验中,一些细胞被转化,一些细胞未被转化,因此需要筛选出被转化的宿主细胞。筛选可利用载体的遗传标志 (genetic marker),如抗生素抗性等来进行选择。

鉴别特定重组克隆 由于种种因素的影响,筛选出来的并不一定是真正转化的细胞,需要作进一步鉴定,可用核酸杂交、免疫化学法 (immunochemistry) 等。另外,由于整合部位等位置效应,外源DNA在宿主细胞内的表达强度等也不同,还需要根据实验的目的进一步弄清目的克隆中外源DNA片段上的基因的结构和功能。主要有酶切图谱的制定、基因在DNA片段上的精确定位、确定是否含有内含子、DNA序列分析、离体翻译实验、外源基因 (exogenous gene) 在宿主细胞中的表达及产物提纯等。