substrate-level phosphorylation一类由产能底物经简单的生物化学反应直接使ADP(或其他核苷二磷酸 化合物)转化成ATP的反应。反应部位在细胞质中。专性厌氧菌或兼性厌 氧菌在无氧条件下的生物氧化方式是发酵，它通过多种底物水平磷酸化反应 产生ATP，产能效率比氧化磷酸化低。
底物水平磷酸化可形成多种含高能磷酸键的产物，诸如EMP途径中的 1，3-二磷酸甘油酸和磷酸烯醇丙酮酸，异型乳酸发酵中的乙酰磷酸，以及 TCA循环中的琥珀酰-CoA等(见表)。在厌氧菌的发酵过程中，有很多反应 可形成乙酰磷酸，例如，在德氏乳杆菌(Lactobacillus delbruckii)中可由丙酮酸 产生，在两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)中可由果糖-6-磷酸产生，在 肠膜状明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)中，可由木酮糖-5-磷酸产生，还 有一些厌氧细菌，其乙酰磷酸可由乙酰辅酶A产生。有了乙酰磷酸后，只要 经乙酸激酶的催化，就能完成底物水平磷酸化产能。
底物水平磷酸化中的11种高能磷酸化合物
| 名称 | 水解自由能(kJ/mole) |
| 乙酰-CoA | 35.7 |
| 丙酰-CoA | 35.6 |
| 丁酰-CoA | 35.6 |
| 琥珀酰-CoA | 35.1 |
| 乙酰磷酸 | 44.8 |
| 丁酰磷酸 | 44.8 |
| 1，3-二磷酸甘油酸 | 51.9 |
| 氨甲酰磷酸 | 39.3 |
| 磷酸烯醇丙酮酸 | 51.6 |
| 腺苷酰硫酸 | 88.0 |
| N10-甲酰四氢叶酸 | 23.4 |