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鱼类胰弹性蛋白酶的研究进展

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胰液中含有三种肽链内切酶,分别是胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶。弹性蛋白酶属于丝氨酸蛋白酶家族,是一种消化酶,在鱼类食物蛋白质的消化过程中承担着重要的生理功能。弹性蛋白酶以水解不溶性弹性硬蛋白(Elastin)为特征,专一性裂解丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸等小的中性氨基酸残基羧基侧链与其他氨基酸的氨基所形成的肽键,具有广泛的水解蛋白活性。 
  弹性蛋白酶主要存在于动物胰脏,在皮肤、主动脉、血小板、白血球中也有存在。鱼类胰弹性蛋白酶主要来源于肝胰脏、肠道和幽门盲囊。结构上,弹性蛋白酶原与胰凝乳蛋白酶原等胰丝氨酸蛋白酶相似,均具有一条信号肽、一条激活肽和一条成熟肽,功能蛋白通过信号肽形成。胰弹性蛋白酶的激活与失活都受胰蛋白酶调节,弹性蛋白酶原在胰腺中合成,并以非活性的酶原形式分泌到消化道中,在消化道中酶原被胰蛋白酶从肽链N端断开肽键,失去一段短肽,分子构象发生一定改变后转变为有活性的弹性蛋白酶。本文综述国内外鱼类胰弹性蛋白酶分离纯化、特性研究、氨基酸组成以及序列分析等方面的研究工作,进一步阐明鱼类消化生理机制,为水产饲料的配制研究提供科学的理论依据。 
   
  1鱼类胰弹性蛋白酶的分离纯化研究 
   
  科学家已经成功分离出了许多哺乳动物的胰弹性蛋白酶,例如猪、鼠及人类,并在此基础上开展了大量研究工作。有关鱼类胰腺丝氨酸蛋白消化酶的研究也有报道,但有关鱼类弹性蛋白酶的研究不多,而且国外要比国内开展得早且深入。已有研究报道了非洲肺鱼、鲤鱼、鲶鱼、鳕鱼、金枪鱼、虹鳟鱼、角鲨、大西洋鲑胰弹性蛋白酶纯化和鉴定工作。国内外鱼类胰弹性蛋白酶分离纯化工作,主要集中在海水鱼类,少有淡水鱼类。 
  胰弹性蛋白酶的分离纯化遵循蛋白质分离纯化的一般原则。总纯化程序可以分为三步:组织样品前处理、粗分级分离和细分级分离,主要是利用蛋白质之间特异性的差异进行分离,如分子的大小、形状、酸碱性、溶解性、溶解度、极性、电荷和与其他分子的亲和性等。常用的分离纯化方法和技术有:沉淀法(盐分级沉淀、有机溶剂沉淀等)、离心、透析、层析法等等。粗分级分离是用盐析和离心等简单的分离方式获得粗品,后期细分级分离获得纯品时偏向于用层析法,其中较为经典的方法为凝胶过滤层析法,离子交换层析法和亲和层析法。通过凝胶过滤层析可脱去盐等小分子杂质。离子交换层析一般是进行阴离子交换,因为鱼类胰弹性蛋白酶在中性及碱性溶液中一般以阴离子形式存在。亲和层析一般采用胰弹性蛋白酶抑制剂作为亲和配体,主要采用亲和层析,填料为Sepharose-4B。如Gunnar I.Berlund等从大西洋鲑鱼幽门盲囊组织中纯化弹性蛋白酶的过程为:用p-aminobenzamidine-Sepharose -6B层析柱去除粗提取液胰蛋白酶,超滤膜浓缩流出液后过phenyl- Sepharose-6 FF层析柱、过Q-Sepharose FF离子交换柱、过SP-Sepharose FF离子交换柱、过铜离子螯合柱去除胰凝乳蛋白酶、最后过Superdex 75凝胶过滤层析柱,完成最后一步精细纯化获得蛋白酶纯品。 
   
  2鱼类胰弹性蛋白酶的特性研究 
   
  在国内,江信红等从黄鳝肠道分离纯化出三种具有弹性蛋白酶活性的同工酶。谢一荣等研究了鱼类弹性蛋白酶等主要消化酶在组织器官中的分布。在国外,有关弹性蛋白酶的研究较国内多且深入。Gildberg A等(1990)分离纯化北大西洋鳕鱼的胰弹性蛋白酶,并就底物特异性、催化效率和稳定性与猪的胰弹性蛋白酶做了比较研究。Smine A等(1995)从角鲨胰提取物中纯化鉴定了胰弹性蛋白酶的两种亚型,EI和EII。两种酶在37℃均对弹性蛋白酶特异性高敏感底物琥珀酰(丙氨酸)3对硝基苯胺(Suc-AAA-pNA)表现出高度的催化活性,但却具有不同的催化参数。Berglund GI等(1998)从北大西洋鲑鱼的幽门盲囊纯化鉴定了胰弹性蛋白酶,对该酶的生物学特性和动力学特性做了深入研究,同时与猪的胰弹性蛋白酶性质做了比较。Ulitina NN等(2005)首次从欧洲鲇鱼中分离纯化了三种丝氨酸蛋白消化酶,包括三种胰蛋白酶的亚型,三种胰凝乳蛋白酶的亚型和两种弹性蛋白酶的亚型。Sakharov IIu等利用离子交换层析法和凝胶过滤层析法从中国鲎的肝胰腺纯化出对特异底物Boc-(Ala)3-pNA具有高度催化活性的弹性蛋白酶,这也是最早有关从甲壳动物中分离纯化出弹性蛋白酶的研究报道。 
  2.1pH值和温度对胰弹性蛋白酶的影响 
  据国内外学者的研究,鱼类胰弹性蛋白酶一般在pH值为5.0~9.0的条件下非常稳定。pH值对弹性蛋白酶活力的影响可通过水解琥珀酰(丙氨酸)3对硝基苯胺(Suc-AAA-pNA)的催化效率来测定。将鱼类和猪的胰弹性蛋白酶做比较,科研人员发现两种酶均在较广的pH值范围内保持了催化能力,但是鱼类耐受酸的能力较差。有个别种属表现出突出的酸碱耐受能力,如北大西洋鲑鱼在pH值为4.0~11.0的条件下仍具有较高的催化活性。大部分鱼类弹性蛋白酶在pH值低于4.0的酸性条件下变得不稳定,有个别种在pH值低于7.0时稳定性降低,如大西洋鲑鱼的最适pH值在为8.0~9.5,当pH值<4.0时酶活性明显降低,可见鱼类胰弹性蛋白酶大都呈中性或弱碱性。同属不同种的鱼类的酶适宜pH值有时也存在明显差异,就是同一种鱼的酶活性在不同的pH值条件下也会有所差异,pH值是影响消化酶活性的关键因素之一。 
  温度是影响酶促反应的重要因素,温度的变化影响酶活力。鱼类生活环境的差异即所在环境温度的变化,对酶的活力也相应地发生影响。一般而言,鱼类消化酶活力的最适温度均高于其所处的环境温度。鱼类胰弹性蛋白酶的最适反应温度在30~60℃范围内,这与大多数消化酶适宜的温度范围相一致,如鳕鱼弹性蛋白酶在45℃反应温度下针对Suc-AAA-pN表现出最高催化效率,但是弹性蛋白酶稳定温度范围与其最适反应温度是不同的,为了研究酶对温度(22~75℃)的耐受力,将鲑鱼和哺乳动物的弹性蛋白酶分别在一定的pH值(2.0~10.5)条件下温浴10分钟,随即在冰上冷却,然后在pH值为2.0和22℃条件下用人工底物测残留酶活力,发现鲑鱼弹性蛋白酶在所有上述pH值条件下,活性较哺乳动物弹性蛋白酶低;两种酶在中性和碱性条件下均比酸性条件下对温度的耐受力要高。 
  2.2胰弹性蛋白酶底物专一性和动力学参数及比较研究 
  底物浓度对胰弹性蛋白酶水解速度的影响可用米氏常数(Km)来表示。它是酶的特征性常数,Km值越小,酶与底物的亲和力越大。将来自于鼠、猪、鲑鱼的胰弹性蛋白酶做比较,水解一系列人工底物Suc-AAPX-pNA(X=a-氨基酸)。结果表明,鱼类弹性蛋白酶针对P1位置表现出亮氨酸、丙氨酸、缬氨酸等氨基酸偏好性。将来自于鲑鱼、鳕鱼、虹鳟鱼、金枪鱼、猪、鼠的胰弹性蛋白酶做比较,水解人工底物Suc-AAA-pNA,其中Km值(mM)分别为1.47、1.02~1.96、2.2、1.2、2.99、1.09~2.0。Kcat值(S-1)分别为3.5、38.5~44.5、184、4.16、2.8、1.59~6.2。Kcat/Km值分别为2.4、19.6~43.2、83.6、3.5、0.9、1.46~3.1。综合上述数据,可知同样条件下测得的鲑鱼、鳕鱼、虹鳟鱼、金枪鱼胰弹性蛋白酶的Km值相近,却比猪的Km值小了近一倍,鲑鱼胰弹性蛋白酶Kcat值(转化率)较猪的胰弹性蛋白酶Kcat值高,从而Kcat/Km值(催化效率)比猪的胰弹性蛋白酶Kcat/Km值高了2.5倍。结果表明,四种鱼类胰弹性蛋白酶与底物Suc-AAA-pNA的亲和力相近,但要比猪胰弹性蛋白酶的底物亲和力小;大西洋鲑鱼弹性蛋白酶作为一种适冷酶为了适应低温的生活环境,催化效率是猪的胰弹性蛋白酶的2.5倍。综合来自鱼类和哺乳动物的胰弹性蛋白酶动力学参数,尽管催化效率各不相同,但鱼类胰弹性蛋白酶拥有比哺乳动物胰弹性蛋白酶更高的催化效率。 
2.3抑制剂影响胰弹性蛋白酶活力的研究 
  胰弹性蛋白酶的抑制剂属于丝氨酸蛋白酶抑制剂家族,是一种能够降低胰弹性蛋白酶活力的物质。以大西洋鲑鱼,鳕鱼和角鲨为例,其弹性蛋白酶活性能被丝氨酸蛋白酶抑制剂苯甲磺酰氯(PMSF)、抑弹性蛋白酶醛(Elastatianl)和MPCMK强烈抑制,表现出丝氨酸蛋白酶家族成员的共有特征。但是苯甲脒、牛胰蛋白酶抑制剂(BPTI)和亮肽素等胰蛋白酶特异性抑制剂对大西洋鲑鱼胰弹性蛋白酶活力却无明显影响,这又表现出弹性蛋白酶与其他丝氨酸蛋白酶家族成员的性质差异。 
  L-半胱氨酸,一种金属离子螯合剂和巯基阻断剂,对鱼类和哺乳动物胰弹性蛋白酶均有抑制效应。但是二价金属离子螯合剂EDTA,对鱼类和哺乳动物胰弹性蛋白酶均无明显抑制效应。体现了不同种属来源的胰弹性蛋白酶的共性。通过比较,发现鱼类胰弹性蛋白酶比哺乳动物胰弹性蛋白酶对PMSF更敏感;碘乙酰胺,一种巯基改良剂,对鱼类胰弹性蛋白酶无影响,却对哺乳动物胰弹性蛋白酶有轻微抑制效应;大豆胰蛋白酶抑制剂能抑制鳕鱼胰弹性蛋白酶活力,对猪胰弹性蛋白酶活力却无影响。上述报道说明,不同种属来源的胰弹性蛋白酶对抑制剂的敏感程度不同,存在差异。 
  2.4胰弹性蛋白酶相对分子质量和等电点的研究 
  鱼类胰弹性蛋白酶的相对分子质量一般是通过SDS-PAGE凝胶电泳测定。硬骨鱼类胰弹性蛋白酶的相对分子质量为24-29KDa。Berglund GI等测得大西洋鲑的胰弹性蛋白酶相对分子质量为27 KDa、大西洋鳕鱼24.8 KDa、欧洲鲇鱼24 KDa、Dover sole19.5 KDa。甲壳动物、哺乳动物和禽类的胰弹性蛋白酶分子质量也在这个范围,如测得中国鲎胰弹性蛋白酶相对分子质量为28.5 KDa,智人26.3 KDa,鼠29KDa,牛29 KDa,绵羊25 KDa,鸡25 KDa。
  总结许多学者的研究报道,鱼类胰弹性蛋白酶的等电点一般在6~9.5范围内。如测得大西洋鲑的胰弹性蛋白酶PI大于9.3、大西洋鳕鱼9.3、Dover sole 5.7。所以,在中性条件下,绝大部分胰弹性蛋白酶都属于中性偏碱性蛋白酶,只有个别鱼类胰弹性蛋白酶为弱酸性,如欧洲鲇鱼胰液纯化得出的两种带电不同的胰弹性蛋白酶亚型的PI分别为6.17/8.48,一种属于碱性胰弹性蛋白酶,而另外一种属于弱酸性胰弹性蛋白酶。 
   
  3胰弹性蛋白酶的序列分析与系统进化分析 
   
  哺乳动物包括猪、鼠、人的弹性蛋白酶氨基酸序列测定已经完成,编码区分别由266、266、269个氨基酸残基组成,具有较高的同源性。鱼类与哺乳动物的胰弹性蛋白酶氨基酸组成存在相似性,但是无论是残基数目还是组成上都存在差异。登陆GenBank能搜索到大西洋鲑鱼和日本比目鱼弹性蛋白酶编码区完整序列信息,分别由181和266/268(EL1/EL4两个亚型)个氨基酸残基组成。将角鲨的两种胰弹性蛋白酶亚型EI和EII的氨基端序列(各20个残基)与人和鼠的胰弹性蛋白酶编码区氨基酸序列进行比对,具有85%的同源性。两栖动物中非洲爪蟾的编码区由264个氨基酸残基组成。 
  生物进化分析是生物信息学的一个分支。它通过对生物序列的研究推测物种的进化历史。主要通过DNA序列,蛋白质序列,蛋白质结构等来构建分子进化树或者种系发生树。将日本比目鱼与其他硬骨鱼如鳕鱼、鲑鱼和哺乳动物如鼠以及人的胰丝氨酸蛋白酶基因构建系统进化分析,从构建的进化树得知日本比目鱼胰蛋白酶基因、胰凝乳蛋白酶基因和弹性蛋白酶基因的首次倍增与硬骨鱼、哺乳动物胰丝氨酸蛋白酶基因构成的簇的首次倍增发生在同时期。硬骨鱼弹性蛋白酶基因与哺乳动物弹性蛋白酶的分歧时间要晚于首次倍增。因此,可以得知胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶的首次倍增早于硬骨鱼类的分化。 
   
  4小结 
   
  弹性蛋白酶是广泛应用于医药工业、食品工业、畜牧业和现代生物技术领域的一种非常重要的酶。目前,弹性蛋白酶主要作为治疗高血脂症、防止动脉粥样硬化的生化药物。同时由于其广谱的蛋白水解活性,不仅在医药工业,而且在食品工业、日化工业上也有着广阔的应用前景和较高的商业价值。较高活性胰弹性蛋白酶的提取利用,还有利于水产品加工过程中废弃物的充分利用。在众多蛋白质水解酶中,胰弹性蛋白酶的年消耗量占酶制品世界市场的比例逐年上升。 
  胰弹性蛋白酶的纯化及其特性的研究,不仅有助于了解胰弹性蛋白酶结构与功能的关系,而且有助于探究鱼类的消化生理特点,为水产饲料的设计提供理论依据,为确立鱼类适宜养殖条件提供基础数据。但是到目前为止,鱼类胰弹性蛋白酶的研究在国内还处于刚刚起步的阶段,迫切需要对胰弹性蛋白酶的基础理论进行更加深入透彻的研究,使该研究领域赶超世界先进水平。 

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