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对狗鱼不同组织同工酶的研究

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摘要:本文采用聚丙烯酰胺垂直板电泳法研究了狗鱼肌肉、心脏、肝脏、脑和眼睛等5种组织的超氧化物脱氢酶(SOD)、苹果酸脱氢酶(MDH)和乳酸脱氢酶(LDH)酶谱。试验结果表明:狗鱼不同组织的SOD酶谱具有明显的组织特异性,每种组织的酶带4~7条不等;狗鱼不同组织的苹果酸脱氢酶共检测到4条酶带;狗鱼不同组织的乳酸脱氢酶共检测到8条酶带。 
   
  狗鱼(Esox americanus Gmelin)属鲑行目,狗鱼科,狗鱼属,即黑斑狗鱼。俗称:狗鱼、鸭鱼。体细长、稍侧扁;口裂极宽大,约为头长的一半;齿发达;背鳍及臀鳍位很后并相对;体侧有斑。狗鱼在产区的天然产量很大,肉质细嫩洁白实不亚于鲤、鲫或大麻哈鱼。 
  狗鱼是在北半球寒带到温带里广为分布的淡水鱼。狗鱼性情凶猛残忍,行动异常迅速、敏捷,每小时能游8公里以上。狗鱼以鱼类为食,食量大,冬季仍继续强烈索食,尤以生殖后食欲更旺。通常在清晨或傍晚猎取食物,其它时间则不再游动,而是静下来休息,并慢慢地消化所吞食的食物,狗鱼捕食时异常狡猾。 
  同工酶电泳技术作为一种实用的生化遗传学研究手段之一,业已广泛应用于鱼类的物种及杂种鉴定、物种间亲缘关系比较及系统分类、基因连锁与基因作图、遗传育种、胚胎发育过程中的基因表达与调空等方面的研究[1]。本实验应用聚丙烯酰胺垂直板电泳法对狗鱼的肌肉、心脏、肝脏、脑和眼睛等5种组织的超氧化物脱氢酶(SOD)、苹果酸脱氢酶(MDH)和乳酸脱氢酶(LDH)进行初步研究,探讨其同工酶的酶谱表现模式及遗传基础的亚基组成,为狗鱼的组织特异性及生化遗传研究提供有价值的参考资料。 
   
  1 材料与方法 
   
  1.1实验样品的采集 
  本研究于2005年9月共采集了来自达赉湖渔场的天然野生狗鱼30尾,均为健康正常个体。体长25~30cm,体重500~~600g。 
  每尾鱼取样前先剪断鱼鳃动脉,放血,活体解剖,肌肉取背鳍后最丰满处的白肌1~2g,肝脏取1~2g,心脏、眼球及脑取全部。用生理盐水在0℃条件下洗去组织污血,称重后放入已编号的冻存管,于液氮中保存。运回实验室后,放在-40℃低温冰箱中保存备用。 
  1.2样品制备 
   肌肉样取0.3g,以1:3的比例(重量g:体积ml)加入0.3% 的 NAD液,于匀浆机中匀浆2min,粉碎组织。用吸管将匀浆后的样品移入冷冻离心管中,在冷冻离心机中以17000r/min 4℃离心20min,最后将离心后的上清液移入到另一个的冷冻离心管中供电泳分析用。肝脏样取0.3g,以1:4的比例(重量g:体积ml)加入0.3% 的 NAD液,匀浆,12000r/min 4℃离心两次,第一次离心后,去除上层的油膜,第二次离心,至上层溶液澄清为止。其它组织样品的制备方法同肌肉样。将制好的样品按4:1比例与指示剂混合,之后放入4℃冰箱备用。 
  1.3同工酶测定方法 
  染色液及脱色液和固定液参照胡能书等[2],以溴酚兰为指示剂。电泳采用的是垂直板聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)方法[3]。已染色的胶条用数码摄像机进行拍片,保存图片,然后用Photoshop7.0的图象处理软件对其图形进行分析。 
  1.4结果记录 
  同工酶的缩写、基因座位和等位基因的命名基本参照Shaklee[3]和Whimore[4]方法。以同工酶缩写名称的大写代表酶蛋白,小写代表编码基因。控制同一种酶的不同基因座位按照从阳极到阴极的顺序依次标记为1、2、3…… 
   
  2结果与分析 
   
  2.1超氧化物歧化酶[Superoxide dismutase(SOD)] 
  狗鱼不同的组织SOD酶谱具有明显的组织特异性(图1)。共检测到7条酶带,每种组织的酶带4~7条不等。肌肉中有m-SOD-4、s-SOD-1、 s-SOD-2和 s-SOD-3等4种带型,其中m-SOD-4和s-SOD-1的活性很强;心脏中有m-SOD-1、m-SOD-2和m-SOD-4等3种带型,它们的活性较弱;肝脏中的带型和心脏一致,但m-SOD-1在肝脏中的活性很强;脑中存在m-SOD-1、m-SOD-2、m-SOD-3、m-SOD-4等4种线粒体型,m-SOD和s-SOD-1带型;眼睛中存在m-SOD-1、m-SOD-2、m-SOD-3 和m-SOD-4等4种带型,而不存在细胞质型。SOD在各组织中的表达强弱如表1所示。 
   
  2.2苹果酸脱氢酶[malate dehydrogenase(MSH)] 
  狗鱼不同组织的苹果酸脱氢酶共检测到4条酶带(图2)。每种组织有1~4条不等。肌肉中只有1条,即为m-MDH;心脏中有m-MDH和s-MDH-3等2条带型;肝脏与眼睛的带型一致,都为s-MDH-1、s-MDH-2和s-MDH-3,但其表达强弱不一致,在肝脏中的表达较强;m-MDH、s-MDH-1、s-MDH-2和s-MDH-3等4条带型在脑中都有表达。MDH在各组织中的表达强弱如表2所示。 
   
   
  2.3乳酸脱氢酶[lactate dehydrogenase(LDH)] 
  狗鱼不同组织的乳酸脱氢酶共检测到8条酶带(图3)。每种组织有1~7条不等,脑中的最多为7条,肝脏中最少为1条。眼睛和心脏具有相同的带型,都有LDH-7和LDH-6。LDH-8在肌肉中的活性较强,各组织的带型如下:眼睛和心脏中存在LDH-7和LDH-6两种带型,但这两种带型在心脏中的表达较强;脑中存在LDH-1、LDH-2、LDH-3、LDH-4、LDH-5、LDH-6和LDH-7等7中带型;肝脏中存在LDH-7带型;肌肉中存在LDH-7和LDH-8等2条带型。LDH在各组织中的表达如表3所示。 
   
   
  3讨论 
   
  3.1关于狗鱼同工酶的组织特异性 
  同工酶是基因表达的产物,不同的同工酶与基因的关系不同。如过氧化物酶由单基因决定,乳酸脱氢酶由多基因决定;同工酶的表现形式还与生物的发育、进化、组织生理、基因的表达调控有关。目前研究表明,同工酶在硬骨鱼类中具有明显的组织特异性[5]。同工酶的组织特异性与组织生理功能相关。同工酶在同一生物体内的不同组织之间由于生物功能的不同而存在差异。本实验结果表明:SOD在狗鱼各组织中存在明显的组织特异性;MDH在狗鱼的肌肉、心脏、和脑中存在明显的组织特异性,而在肝脏和眼睛中不存在组织特异性;LDH在狗鱼的眼睛、脑和心脏中存在明显的组织特异性,而在肝脏和肌肉中不存在组织特异性。 
   
  3.2关于酶的遗传基础 
  SOD为二聚体酶,一般有s-SOD和m-SOD两种类型[6]。通过17%的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测狗鱼5种组织的SOD。狗鱼的SOD也存在有相互不形成异聚体的细胞质型s-SOD和线粒体型m-SOD两部分,s-SOD形成典型的二聚体3条酶带,其基因型可能分别为s-SOD(A2)、s-SOD(AB)、s-SOD(B2)[7]。m-SOD有4条酶带,各酶带的迁移率一致,但活性不同。 

一般来说,鱼类在肌肉组织中存在两类MDH,有4个基因座位编码,有细胞质型(s-MDH)和线粒体型(m-MDH)[8]。本实验通过8%的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测出狗鱼5种组织的MDH为二聚体酶,有移动较快的细胞质型(s-MDH)与移动较慢的线粒体型(m-MDH)。m-MDH只形成同二聚体,肝脏、脑组织和眼睛中的s-MDH都形成典型的二聚体3条酶带(如图2所示),其基因型为s-MDH(B2)、s-MDH(AB)和 s-MDH(A2),但各组织的活性不一致。其中m-MDH在肌肉、心脏和脑组织中都表达,只是活性强弱不同,在脑组织中活性最强。s-MDH除在肌肉中不表达,在心脏中只表达s-MDH-3,在肌肉、心脏、肝脏中三条带都表达,肝脏中表达活性最强,肌肉中最弱。 
  LDH为四聚体。对鱼类的LDH同工酶的研究,前人已作过了许多工作。硬骨鱼类都有A、B、C3个位点,二倍体硬骨鱼类中的A、B位点普遍存在于各组织器官中;C位点的器官分布,随鱼的不同而不同,常见于眼睛、肝脏等组织[9]。本实验通过7%的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测狗鱼5种组织的LDH,结果表明狗鱼的五种组织都具有LDH酶活性,共检出8条带,酶谱多于LDH典型的5条带。达赉湖狗鱼的LDH按迁移率分为LDH-1、2、3、4、5、6、7、8。上述结果由于实验方法不同,也许与其他研究人的研究结果不太一致 。 
   
   
  参考文献 
  [1] 王宏伟,王安利,王维娜,等鱼类同工酶研究进展[J].动物学报,2001,47(专刊):101 - 105. 
  [2] 胡能书,万贤国.同工酶技术及其应用[M].长沙:湖南科学技术出版社,1985.73-85. 
  [3] Shaklee J B,Allendor F W,Morizot D C,etal.Genetic Nomenclature for protein-Coding Loci in Fish [J].Trans Am Fish Soci,1990.119:2-15. 
  [4] Whitmore. Electrophoretic and isoelectric focusing technique in fisheries management [M].Boston:cpc press,1990.28-30. 
  [5] 黄海,尹绍武,张本,等.奥尼罗飞鱼5种组织中4种同工酶的研究. 南方水产,2006,1:11 - 17. 
  [6] 潘峰,胡枚,王和海.奥利亚罗飞鱼血蛋白和组织同工酶电泳图谱的特异性研究[J].淡水渔业,1993,23(2):7 - 10. 
  [7] 姜建国,熊全沫,姚汝华.草鱼同工酶的组织分布及遗传结构分析[J].华南理工大学学报:自然科学学报,1997,25(12):105 - 110. 
  [8] 尤峰,王可玲,相建海,等.山东近海牙鲆同工酶的生化遗传分析[J].海洋与湖沼,1999,30(2):127 - 133. 
  [9] 刘静,尤峰,李春生,等.中国鲳属鱼类同工酶谱分析.海洋科学,1999,5.10-18. 

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