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DcELISA检测泥鳅、鲫鱼中氯霉素残留方法的应用

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摘要:应用直接竞争酶联免疫吸附试验方法(dcELISA)快速定量测定泥鳅、鲫鱼肌肉中氯霉素(CAP)残留量。氯霉素浓度在0.05~10ng/g范围内具有良好的线性关系,线性方程为y=-0.33-1.88x,r2=0.995,向样品中分别添加0.1、0.3、0.9ng/g三个浓度水平的氯霉素标准品,泥鳅样品的平均回收率分别为87.2%、88.9%、93.0%,鲫鱼样品的平均回收率分别为86.1%、79.9%、99.0%,最低检测限为0.05ng/g,批内变异系数为8.0%,批间变异系数为7.2%,结果表明该方法灵敏度高,重复性好,适合在泥鳅、鲫鱼肉样中氯霉素残留筛选检测。 
  关键词:氯霉素残留;直接竞争酶联免疫法;泥鳅;鲫鱼 
   
  氯霉素(Chloramphenicol,CAP)最初是从委内瑞拉链丝菌(Streptomyces Venezuela)的培养液中提取制得,是一类广谱抗生素。氯霉素对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌具有明显的抑制作用,氯霉素由于其优良的抗菌性、稳定的药性和廉价,曾是我国水产养殖中常用的抗菌药之一,长期作为饲料添加剂和细菌性疾病的治疗用药[1]。近年来,研究发现氯霉素存在着严重的毒副作用,易引发再生障碍性贫血、粒状白细胞缺乏症以及新生儿、早产儿灰色综合症等[2]。因此,动物性食品中的氯霉素残留问题一直备受关注,引起国际组织和世界上许多国家和地区的高度重视。中国农业部已将氯霉素从2000年版《中国兽药典》中删除列为禁药,而欧盟的进口食品卫生标准规定“氯霉素含量标准为不得检出。”[3] 
  目前,氯霉素残留分析主要采用气相色谱法和高效液相色谱法。高效液相色谱法虽然操作简单,但检出限较高,无法满足当前对氯霉素低残留限量的要求。气相色谱法灵敏度较高,但样品前处理过程复杂、分析速度慢、仪器价格昂贵,不适合在基层推广使用[3-4]。自1984年Campbell等建立检测CAP的ELISA以来,国外研究进展较快,国内研究相对滞后。随着ELISA技术的发展直接竞争酶联免疫吸附试验法(dcELISA)越来越体现出更多的优势,基于抗原抗体特异性反应建立起来的dcELISA,具有简单、快速、处理样品量大、灵敏度较高、特异性强等诸多优点,可以直接用于生产实践,适用于大规模氯霉素残留筛选检测。 
   
  1材料与方法 
   
  1.1材料和仪器 
  Multiskan MK3酶标仪,产地:芬兰;AL104电子天平,产地:上海;FSH-2可调高速匀浆器,产地:常州;DT5-1离心机,产地:北京;乙酸乙酯、正己烷,分析纯,北京化学试剂公司;氯霉素、氯霉素碱、甲砜霉素、氟甲砜霉素、氟苯尼考等标准品,北京兽药监察所;氯霉素ELISA快速检测试剂盒,北京中检维康技术有限公司;生物样品来源,市售。 
  1.2样品的前处理 
  实验所采用样品为泥鳅、鲫鱼,分别取肌肉充分剪切、混匀,用高速组织匀浆器破碎,密封袋密封,标记后-20℃保存。 
  称取制备的样品3g置50ml离心管中,加入6ml乙酸乙酯,用振荡器强烈混合10min;室温3000g离心10min;取2ml上清液(相当1g样品)在50℃氮气流下吹干;用1ml正己烷溶解干燥的残留物,加入1mlPBS缓冲液振荡混合10min,室温3000g离心10min;去上清液(正己烷),取100μl下层水相用于检测。 
  1.3抗体交叉反应的测定 
  抗CAP抗体抑制物分别采用倍比稀释的氯霉素碱、甲砜霉素、氟甲砜霉素、氟苯尼考,计算各竞争物的IC50, 比较抗体对它们的亲合性。同时,用下式计算各竞争物与抗CAP 抗体的交叉反应。 
  交叉反应性(%)=IC50(CAP)×100/IC50(竞争物) 
  1.4分析程序 
  将所需的的微孔条插入微孔架,每个标准品和样品做2 个平行,记录标准品和样品的位置。加入100μl标准品或处理好的样品到各自的微孔中,再加入50μl 稀释了的抗氯霉素抗体酶标记物于微孔内。充分混合,覆盖上薄膜,室温孵育1h。倒出孔中的液体,将微孔架倒置在吸水纸上拍打3次,完全除去孔中的液体,每次用250μl洗涤液洗板4次、排干。洗板后加入100μl底物到每个微孔中,充分混合并在室温暗处孵育15min。加入50μl,2M H2SO4终止液终止反应,用酶标仪在450nm处测量吸光度值(OD值)。 
  1.5标准曲线的制作及样品浓度的计算 
  将所获得的标准品和样品的OD值按下式折算成百分比吸光度值: 
  % 吸光度值 = 标准品或样品的OD值 × 100 / 空白标准品的OD值 
  以标准样品浓度为横坐标,标准样品的 % 吸光度值为纵坐标,绘制对应氯霉素浓度的半对数校正曲线,样品浓度根据测得的OD值从校正曲线上读出。 
   
  2结果 
   
  2.1标准曲线 
  按照1.4步骤,分别测定浓度为0、0.05、0.1、0.3、1、3、10ng/ml氯霉素标准液的OD值,采用RIDASCREEN 数据分析软件建立标准曲线(图1、图2),由图2曲线可知氯霉素浓度在0.05~10ng/ml范围内呈线性,线性方程为Y = -0.33-1.88X。相关系数:r = 0.997 
   
  2.2回收率 
  向样品中分别添加3个浓度水平的氯霉素标样:0.1、0.3、0.9ng/g,每个浓度做4个平行,同时做4个空白样。按1.2处理后测定氯霉素含量,计算回收率,结果如表1所示。 
   
  2.3灵敏度 
  按照1.4步骤同时测定10个“0”标准溶液的OD值,求出其平均值(X),再减去两倍标准差(SD),从标准曲线上查出对应于OD值为X-2SD的浓度,即为灵敏度。该方法的平均灵敏度为0.05ng/g。 
  2.4精密度 
  采用变异系数表示法,在同一次测定中对3个浓度水平的样品分别重复测定5次,计算批内变异系数。分别测定3个浓度水平的样品在3个不同批次测定之间的变异系数,即为批间变异系数。结果如表2所示。 
   
  2.5交叉反应 
  CAP抗体与结构类似物的交叉反应结果见表3 
   
  3讨论 
   
  目前文献报道的氯霉素的dcELISA针对水产品的检测的报道较少。本试验是参照“鸡肉和牛奶中氯霉素的提取方法”而建立的水产品中氯霉素提取方法[1-2],结果表明dcELISA对水产品中氯霉素残留检测方法灵敏度高,重复性较好,与间接竞争ELISA(icELISA)相比缩短了检测时间和操作步骤,减少了操作误差,更适用于水产品中氯霉素残留的筛选[6]。与气相色谱法相比,ELISA方法样品处理简单方便,尤其适合大批量的检测,并且成本低。因此采用dcELISA方法既可减小实验室的劳动强度,又可节约检验费用,在现场监控和基层检测中有着广阔的推广应用前景,是药物残留检测发展的趋势。本方法在操作过程中应注意的是加入正己烷溶解残渣再与PBS混合时,剧烈的振荡,易产生乳化,从而导致分离不彻底。另外,洗板也是本试验成功与否的关键,如果是手工洗板,将洗板次数增加1~2 次,可提高检测准确度。ELISA方法检测结果往往会出现假阳性,因此,慎重起见,对检出的阳性结果还需用气相色谱法进行进一步验证。 
   
  参考文献 
  [1] 魏书林等.鸡肌肉组织中氯霉素残留ELSIA检测方法的研究[J].中国兽医杂志,2004,40(9):7-9. 
  [2] 石德时等.氯霉素间接竞争ELSIA(ciELSIA)检测方法的建立[J].中国兽医杂志,2002,22(1):77-79. 
  [3] Allen E H. Review of chromatographic methods for chloramphenicol residues in milk,egg and tissues from food producing animal[J]. J Assoc Of Anal Chem,1985,68:990-999. 
  [4] Wal J M. High performance liquid chromatographic determination of chloramphenicol in mink [J].J Assoc Of Anal Chem,1980,63(5):1044-1048. 
  [5] 蒋定国等.高效液相色谱法测定牛奶中氯霉素残留量的研究[J].中国食品卫生杂志,2003,15(1):36-38. 
  [6] 沈美芳等.用酶联免疫法测定水产品中氯霉素的残留量[J].南京师范大学学报,2003,3(2):1-4. 

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