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鱼类精液超低温冷冻

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鱼类精液超低温冷冻     

利用低温甘油冷冻鱼类精子解冻后精子活力及受精率达到较高的水平。

鱼类精子在精巢和精浆中是不活动的。只有当其排放到外界水体中才会被激活运动。各种鱼类精子运动的诱导机制不尽相同,鲑鳟鱼类精子在精浆中不运动主要受高K+浓度抑制,当环境K+降低时就会激活精子运动;鲤科鱼类精子的激活则是由外环境的低渗所诱发。而海水鱼类精子的激活则是由海水的高渗所激。冷冻保存精子的原理就是用能抑制精子运动并能提供部分营养的稀释液稀释精液,通过添加一定浓度的抗冻剂,降低细胞的冰点,减少冷冻过程对细胞的冷冻损伤,采用适当的降温速率,使精子安全越过—60℃冰晶形成区,进入—196℃的液氮温区。在此温度下,精子运动和代谢完全停止,处于假死状状,基本上可以进行长期、实际上是无限期的保存。鱼类精子超低温保存主要包括如下几个步骤。

目录

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稀释液配制 

精液冷冻稀释液包括基础溶液和抗冻剂二部分。现将近年来文献报道的,适合几种鱼类精液冷冻保存的基础稀释液组成列于表。

鱼类精液冷冻保存基础稀释液组成

种类 稀释液组成
大西洋鲑蔗 糖 125mM, 谷 胺 甘 肽 6.5mM,
KHCO3100mM
虹鳟NaCl100mM,KCl23mM,CaCl25.4mM,Mg-
SO41.3mM,Tris~Citricalid,200mM,牛血清
白蛋白0.4%,PromineD0.75%
虹鳟葡萄糖5.4%,蛋黄10%
草鱼鲢鱼
鲤鱼、团头鲂
NaCl0.8~0.9%、KCl0.05%、葡萄糖1.5%
鲤鱼NaCl0.75%,KCl,Kcl0.02%,CaCl20.02%,
NaHCO30.02%
罗非鱼NaCl0.65%,KCl0.3%,NaHCO30.03%,Ca-
Cl20.02%
构成稀释保护液的另一重要成份是抗冻剂。目前采用的抗冻剂主要有甘油,二甲亚砜(DMSO)和甲醇。甘油为海水鱼类精子的有效抗冻剂。适宜浓度为11~20%;DMSO为淡水鱼类清液的有效抗冻剂,最佳浓度为10%左右。而甲醇(10%左右)对罗非鱼和斑马鱼精子有很好的抗冻保护效果。抗冻剂与基础稀释液一般预先混合好后置冰箱(0~4℃)预冷备用。

采精与稀释 

用挤压法采取无尿污的精液,经显微镜检查精子激活率在90%以上者用于冷冻保存。精子活力用激活后视野中运动精子的百分率表示。寿命用90%以上精子停止运动的时间表示。镜检活力后即可用含有抗冻剂的稀释液稀释精液。将稀释液一抗冻剂混合物分2~3步添加到一定量精液中,精液与稀释保护液的混合比例以1:1~1:3为宜。抗冻剂在最终混合物中的终浓度一般以10%左右为宜。

平衡与冷冻 

冷冻精液的方法主要包括颗粒冻精法、安瓿瓶法和麦细管法三种。麦细管法冷冻效果最好,操作最方便。麦细管的容量以0.25~1.5毫升为多见。将预冷的精液—稀释液—抗冻剂混合物分装入塑料管后置0~4℃平衡一定时间。平衡时间长短因抗冻剂种类而不同。对于用DMSO保护的精子,冻前无需平衡也能获得满意的结果。对于用甘油保护的精子则一般需要一定的平衡时间(30~60分钟)。冷冻时,先将精样放在液氮罐口下(约—6℃左右)预冻10分钟,再降至液氮而上一定距离处(约—140~—180℃)冻结10分钟;最后浸入液氮中保存。降温速率一般以~30℃/分钟为宜。

解冻 

解冻方法一般为将冻精小管先从液氮中提升至液氮蒸气中回温5~10分钟,然后迅速拿出放在25℃左右(用于鲑鳟鱼类)或37~39℃(鲤科鱼类)的水浴中摇动,注意不能让水进入小管内。待小管内大部分冻精融化,只剩一点点冰屑时即可停止。当小管从水浴拿出时,应该手感冰凉为好。

授精 

取一定量鲜卵置容器中,滴加一定量冻精后摇匀,再滴加适量0.8%左右的NaCl溶液,摇匀后加自来水孵化。冻精解冻与授精间隔时间应越短越好。冻精用量的多少应视解冻后精子的存活率而定。当冻精活力为60~70%时,用3~6倍于鲜精的冻精量即可获得与鲜精近似的受精率。胚胎发育至原肠后期计算受精率,发育至眼点出现期计算发眼率。

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