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对虾病毒病

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对虾病毒病 Viral Disease of Penaeid shrimp

症状 世界上,养殖的对虾约20余种,我国有近10种。1990年开始在我国沿海小范围发生对虾病毒病,1993~1994年在全国大面积暴发对虾病毒病。病虾一般靠近水体表层游泳,有时旋转运动,行动缓慢,反应迟钝,停止吃食和生长。体表和鳃上容易附生底栖硅藻、自由生活的原生动物和丝状细菌等。头胸甲和尾部表壳上长满了白色斑点,病虾最终卧于池底死亡。

危害性 1993年和1994年,我国沿海养虾地区大面积暴发虾病,几乎70%的养殖面积发病。总共减产对虾十几万t,直接经济损失几十亿元,使我国从一个年产20多万t养殖对虾产量的高产国家一下变成对虾进口国。

病原 病原体是病毒。一种对虾可被多种病毒感染,一种病毒可感染多种对虾。国内外已见报道的对虾病毒近20种,但真正引起对虾大量暴死的病毒主要有四种: 对虾杆状病毒 (Baculovirus Penaei,BP),可引起幼虾和溞状幼体 (zoaea) 及糠虾 (nysis) 急性死亡,24~48h内死亡率为100%。斑节对虾杆状病毒(Monodon Baculovirus,MBV),易感宿主主要是在对虾幼期,发病后3~5d死亡率为100%。黄头杆状病毒(Yellow-head Baculovirus,YBV),感病的对虾在10d内死亡率为100%。传染性皮下组织和造血器官坏死病毒 (IHHNV),幼虾在感病后2~3周时死亡率90%。对虾病毒已呈全球分布状态。许多无病症的对虾并非健康,很可能是病毒的携带者。对虾病毒病的传播分纵向和横向两条途径。患病的亲虾通过卵巢 (ovary)或卵膜将病毒传给后代,这是纵向传染途径; 横向传染是通过吞食或接触带有病毒的食物或水体等引起感染。如对虾一旦感染了IHHNV,便成为该病毒的终生携带者,并传给后代。

防治方法 筛选、培养抗病虾品种; 虾池的彻底消毒; 提高监测水平,及时清除带毒亲虾; 隔离带毒幼虾,消毒或销毀; 加强防病养殖措施。适时清理消毒虾池,合理确定放养密度,提高饵料质量,改善养殖水体的小环境等综合管理方法,增强对虾抗病毒病的能力,到达增加对虾产量的目的。

 

 

 

对虾养殖是我国海水养殖的支柱产业之一,也是一些发展中国家重要的创汇水产业。但随着对虾人工养殖集约化的发展,疾病特别是大规模暴发性流行病成了阻碍这一产业发展的重要因素。1993年与1992年相比,我国养殖对虾产量锐减十多万t。1994年重蹈覆辙,至今仍难以恢复90年代初的产量。近年对虾病害的蔓延不仅使我国养虾业严重受创,而且已在日本、泰国等国家和地区造成严重危害,使之成为世界性问题。因此,关于对虾病害的病因研究及其防治已成为我国乃至国际上的有关科学家和管理人员都在关注的事情。现有资料表明,引起养殖对虾暴发性流行病的一个重要原因是病毒 (virus)。为此,本节介绍对虾病毒 病研究的动态和进展。

对虾病毒的名称及种类 现已见报道的对虾病毒已近20种。它们是: 对虾杆状病毒 (baculovirus penaei,BP),斑节对虾杆状病毒 (monodon baculovirus,MBV),中肠腺坏死杆状病毒 (virus of baculovirusmidgut gland necrosis,BMN or BMNV),传染性皮下组织和造血器官坏死病毒 (infectious hypodermal &haemopoietic necrosis virus,IHHNV),肝胰腺细小病毒 (hepatopancreatic parvolike virus,HPV),呼肠孤病毒 (reovirus,REO),黄头杆状病毒 (yellowhead baculovirus,YBV),白斑杆状病毒 (whitestriate baculovirus,WSBV),弹状病毒 (rhabdovirus,RV),淋巴样器官细小病毒 (lymphoidorgan parvovirus,LOPV),C型杆状病毒 (typeC baculovirus,TCBV),淋巴组织空泡化病毒 (lymphoid organ vacculizationvirus,LOVV),淋巴组织杆状病毒 (lymphoid organ baculovirus,LOBV),澳洲对虾杆状病毒 (plebejus baculovirus,PBV),对虾血细胞杆状病毒 (penaeid haemocytic rodshaped virus,PHRSV),血细胞非包涵体杆状病毒 (hemocyteinfection nonoccluded baculovirus,HNBV),类呼肠孤病毒 (roelike virus,RLV),日本对虾非包涵体杆菌状病毒 (nonoccluede bacilliform virus infection in Penaeus japanicus,PjNBV),系统性外胚层和中胚层杆状病毒 (systemic ectodermal and mesodermal,MBV) (Momoyam等,1988a,b; 1989; Brnami等,1992; Owens,1993; Lu,等,1994; Chainarong Wongteerasupaya等,1995)。

严格地说,如按病毒学的分类命名对感染对虾的病毒进行分类就没有如此多的种类,但在生产实践中,人们习惯按病毒的形态及引起宿主的发病症状 (如对虾白斑杆状病毒、黄头杆状病毒等),或按最先观察到病毒感染宿主的组织、器官以及出现病理变化的部位 (如中肠腺坏死杆状病毒、传染性皮下组织和造血器官坏死病毒等) 对病毒进行命名。除了上述对虾病毒种类之外,还有些已见报道的对虾病毒在此并未一一列举(Lu,等,1991; 严携箕1995)。

上述19种病毒分属于6个病毒科: 杆状病毒科 (Baculoviridae,如MBV),细小病毒科 (Parvovirdae,如HPV),小RNA病毒科 (Picornaviridae,如IHHNV),呼肠孤病毒科 (Reoviridae,如REO),弹状病毒科(Rhabdoviridae,如RV),披盖病毒科 (Togaviridae,如LOPV) (Lightner等,1992; Lu等,1991)。在这六个科中,要数杆状病毒科家族最大,半数以上的对虾病毒归于此科。

感病虾的发病症状 感染了病毒的对虾呈现出一系列相似的症状: 尾部棉白化、生长缓慢、摄食量减少、附着物多、污损面广、体色加深、斑块出现。由于表面共栖生物的污缠,导致尾扇活动能力下降(Couch,1974; Nash等,1988),然后可能有细菌和真菌乘虚而入,使组织受到更大面积的伤害,发病率增高。但一种病毒可能只使某种对虾发病,却不使另一种对虾表现病症。如IHHNV对蓝对虾 (Penaeusstylirostris Stimpson) 的致死力很强,而对南美白对虾 (Penaeus vannamei Boone) 的影响很小 (Bell等,1987;Lightner等,1987b)。一般认为: 对虾发病与否不仅与病原 (病毒) 有关,还与宿主 (对虾)、和养殖环境密切相关。因此,在疫区无病症的对虾也许已经带毒,一旦条件适合就可能引起病毒病暴发流行。因此在引进虾种虾苗时应采取必要措施进行检测,防范于未然。

已见报道的对虾病毒虽有多种,但危害严重的病毒名称及其致死率见下述: BP: 可引幼虾和未成年虾(蚤状幼体和康虾期) 急性死亡,24~28h内死亡率为100%。MBV: 易感宿主主要是在幼期,发病后3~5d死亡率为100%。YBV: 感病对虾在10d内死亡率100%。IHHNV: 幼虾在感病后2~3周时死亡率90%。因此,对这几种对虾病毒要特别警惕,注意防范。

病原的性质

对虾病毒病的分布 现在美国、法国、巴西、以色列、秘鲁、新加坡、菲律宾、日本、德国、澳大利亚、韩国、印度尼西亚、马来西亚、泰国、中国台湾省及沿海等国家和地区,均已发现对虾病毒病的存在(Lightner等,1987a; 1989; 1993; Sano等,1981; Tsin g等,1987; Vickers等,1993; Nash等,1988; 江育林等,1995),由此可知对虾病毒病已遍布全球。此外还甚至在某些有养殖对虾的国家和地区造成严重危害,如前些年在泰国、近年在日本、中国等地都发生过对虾病毒病的暴发流行。

对虾病毒病的传播 对虾病毒病的传播分纵向和横向两条途径。纵向传染是指患病的亲虾 (brood shrimp) 通过卵巢或卵把病毒传给后代; 横向传染是指通过吞食或接触带有病毒的食物或水体等而引起的感染。感染了IHHNV的对虾是这种病毒的终生携带者,并能传给后代,引起纵向传播 (Lightner et al.,1983b)。病毒的感染与某些因子有关 (Bray等,1994),给健康斑节对虾 (Penaeus monodon Fabricius) 喂食带有YBV的对虾或把病虾内脏搅碎稀释12 000倍,放入健康虾的水箱内,都可使健康对虾感染YBV(江育林,1994)。Monoyama等 (1988),证实在接种了BMNV的水体中,日本对虾 (Penaeus japonicus Bate) 的幼体可被感染。他还发现BMNV既能横向传播,也能纵向感染日本对虾。

对虾病毒病原的形态、结构及大小 感染对虾的病毒在形态、结构及大小等性质上呈多样化。病毒有的呈杆状,有的是球形,某些病毒有包涵体而另一些则无包涵体。病毒基因组所含核酸类型有的是DNA,有些则为RNA。现举例说明,HNBV是一种属于C型有囊膜的杆状病毒,其大小为120nm×360nm,是已知对虾病毒中最大的一种,核酸类型是DNA;IHHNV是一种球形、无囊膜病毒,其直径大小为22nm,是已知对虾病毒中最小的一种,属小RNA病毒。

病理学观察

病虾组织和器官的病理变化 对虾病毒作为病原可引起宿主产生包括细胞、组织器官以至整个肌体的一系列病理变化或出现明显的病症,进而引起群体发病并导致更大范围的病害流行。

对虾细胞的病变。吴友吕等 (1994) 对长毛对虾 (Penaeus penicillatus Alcock) 组织切片进行电镜观察,在病虾中肠前段、肝胰腺上皮细胞核和质及腹肌纤维间质中看到了大量密集和散布的具囊膜的杆状病毒。他们认为该病毒属于具囊膜的杆状病毒C亚群。这种病毒引起病虾中肠和肝胰腺上皮细胞的主要病变为细胞核肥大、畸形,核内被病毒占据、染色体着边、缩小,核仁解体分离、核膜增厚,内质网、线粒体减少。陈细法等 (1994) 就感染了MBV的草虾肝胰腺上皮细胞的病理变化,尤其是胞质细胞器和内含物的超微病理变化作了较详细地描述: 在MBV感染初期,胞质局部水肿,细胞器分布不均,水肿区域内空无细胞器。然后,部分粗面内质网脱颗粒,排列有序的片层状结构变得紊乱。平面内质网明显增生。线粒体由长形、椭圆形变成多种形态: 有的体积增大,成为巨线粒体; 有的分枝成为树状; 有的水肿,脊断裂或脊消失,成为无 结构的空白区。

对虾组织和器官的病变。肝胰腺: 对虾肝胰腺是由许多管状小室组成,管壁内紧密地排列着不同功能的细胞,包含有未分化的胚胎细胞 (E细胞),E细胞可进一步分化出四类细胞: F细胞、R细胞、B细胞和中肠细胞。多数对虾病毒引起的组织病理变化是发生在肝胰腺,而且初期主要是肝胰腺内的F细胞、R细胞受染并发生病变,病毒感染后在细胞核内形成包涵体或在细胞质内形成包涵体。由于包涵体和病毒粒子的存在,使细胞和胞核肿大、细胞器分布不均、大小形态改变,功能丧失。细胞破裂后,病毒或包涵体从中游离,它们可通过肝胰管腔,经中肠进入消化道; 也可穿过结缔组织膜进入体腔内的血窦中,随血淋巴流动感染其他的器官和组织。通常包涵体只在F细胞、R细胞和B细胞中观察到。中肠上皮: 细胞质出现颗粒变性、核消失坏死,上皮细胞局部与基膜脱离。淋巴组织: 由于病毒的破坏或代谢障碍,出现淋巴细胞坏死和淋巴组织局部萎缩,细胞间质面积扩大,淋巴细胞减少等现象。卵巢: 病毒可在卵母细胞内形成圆形、体积较大的包涵体,而且包涵体数量较多,对卵母细胞造成严重破坏并可引起卵巢局部坏死。

对上述组织的病理学检查还可以发现多病灶、弥漫性坏死现象 (薛清刚等,1992; 王云祥等,1994)。

对虾病毒病的诊断方法 到目前为止,及早发现和确诊对虾是否被病毒感染,并采取相应措施防止病毒病流行扩散是减少生产中损失最有效的途径。因此了解和掌握对虾病毒病的诊断方法是十分必要的。现在人们报道的对虾病毒病的诊断方法虽有多种 (Mialhe等,1992; Lightner等,1992; Brock 1992),但可归纳为 下述六类。

显微镜观察 从大量的镜检观察中,人们发现和总结出一些特征性的数据或指标,使显微镜技术成为用于对虾病毒鉴定和诊断的重要方法之 一。显微镜观察既可采用光镜,也可通过电镜进行。在普通光镜下,可见到感病对虾组织甚至细胞发生的病理变化。如果配合使用适当的染色技术,在普通光镜下还可以观察到包涵体。在此介绍几种对感病对虾新鲜组织 (如肝胰腺或中肠) 进行染色处理后,在光镜下快速检测杆状病毒 的实用方法。

几种在光镜下快速检测杆状病毒的方法

病毒  染色和观察方法   参考文献
 MBV  0.5%孔雀石绿染色压片、涂片、苏木精
染色、伊红染色
 Lightner,1983
Vickers等,1993
 MBV和BP 0.001%焰红(phloxine)染色,荧光显微
镜观察 
 Thurman等,1990 
 BMNV  孚尔根染色
荧光抗体的方法
暗视野显微镜
 Monoyama,1983
Sano等,1984
Monoyama等,1988

王克行等 (1993) 对HPV感染后的病虾 (感病较轻的) 组织切片病变的情况进行观察,可见细胞核明显膨大,核内有一个或多个包涵体。包涵体在形成早期为轻度嗜碱性,HE (Haematoxylin and eosin) 染色为紫红色; 而在后期包涵体为嗜酸性,HE染色为紫蓝色。这被认为是HPV的一个特征,可供诊断时参考。孙修勤等 (1996) 报道了中国对虾肝胰脏细小报道的组织学研究结果,指出在患病对虾肝胰脏的上皮细胞核内,经孚尔根反应可见包涵体,据此可简易诊断该病。

从最初Couch (1974) 报道对虾病毒到现在,人们就研究病毒在对虾组织中的分布、感染、病变等进行了大量的电镜观察,并有相应的报道 (Lightner等,1981; 1983; 1985; 1987; Roubal等,1989; Thurman等,1990)。包涵体及病毒囊膜的有无、多少等也是用显微镜对对虾病毒及其病理学研究的一个重要内容。当然对此会仁者见仁、智者见智。据Lester等 (1987) 的观察结果表明,PBV有两层电子致密的囊膜,而MBV只有一层; 但是Halder等 (1989) 否认了这一观点,认为MBV也有两层囊膜。这方面的研究工作目前仍在深入地进行 (Lightner等,1993),如最近Lu等 (1996) 还报道了经电镜观察到的MBV感染对虾细 胞引起的形态变化情况。

邹国祥等 (1994) 就感病对虾肝胰腺肌上皮细胞病变的情况进行了观察,得到的结果表明,被属于BMNV型病毒感染的对虾肝胰腺肌上皮细胞有三种不同的类型: ①核明显肥大,中央区电子密度明显降低 (中央亮区) 可能为病毒发生基质的前期; ②核中央亮区出现散在的电子致密区。主要由大量空囊 (empties)和少数装配完整的杆状病毒粒子组成; ③核内完整病毒粒子明显增多,空囊减少,核被膜外层断裂,消失,胞 质溶解。

电镜用于研究对虾杆状病毒其视野已不局限于观细胞病变、病毒的分类,而且扩展到用于了解病毒的感染和复制。张立人等 (1994)、张建红等 (1994) 描述了他们用电镜观察对虾杆状病毒在体内的感染、发生 与装配的研究结果。

生物测定 利用某些宿主对虾对病毒侵染易感的特点,将其作为指示虾,可对对虾病毒病进行检测。如蓝对虾 (Penaeus stylirostris Stimpson) 感染病毒后,症状很明显。当把怀疑带病毒的对虾组织投喂给它; 或将这种对虾组织匀浆后的上清液注射到指示虾体内,观察反应。如果被检者带有病毒,则可传染指示虾,在实验2~3周将出现相应的病症 (Bell等,1987),据此可诊断样虾是否被病毒感染。

免疫学方法 早些时候,两种常规的免疫学方法已引用到对虾病毒病的检测中,这就是Sano等 (1985)将荧光抗体 (fluorescent antibody) 技术用于BMNV的诊断,Lewis (1986) 则运用酶联免疫吸附实验(ELISA) 对对虾病毒进行了检测,这种方法较为灵敏,如在100μl液体里含有10ng的对虾病毒蛋白,就可 用此方法测出。

在对异物识别的免疫反应中,无脊椎动物 (invertebrate) 主要是通过血细胞的吞噬与包囊、介导的凝固与凝集、产生杀菌物质等。因此对对虾血液成分、细胞超微结构和类型进行分析已使人们产生了浓厚的兴趣。Martin等 (1985) 等报道了关于对虾血细胞的分类方法和电镜观察结果,他们将中国对虾[Penaeuschinensis (Osbeck)] 的血细胞分为透明细胞、小颗粒细胞和大颗粒细胞等三类。近年国内也有学者开展了这方面的研究。叶淑芳 (1991) 曾尝试用测定人体免疫球蛋白的方法检测对虾体液中的类似物质,结果表明,IgA、IgG、IgM均呈阳性。叶燕玲等 (1993) 研究了中国对虾循环血细胞的超微结构、分类和计数。可以肯 定这些研究将会促使免疫学方法在对虾病毒病诊断中得到更广泛地运用。

细胞培养 细胞培养技术是病毒学研究的基础,也是用于病毒病诊断的基本方法之一。80年代中期,Chen等 (1986; 1989) 对虾细胞的培养及病毒感染进行了尝试。3年后他们报道将MBV感染日本龙虾的胸腺细胞获得成功。Loh等 (1990) 将对虾病毒IHHNV接种到鲤上皮乳头瘤细胞 (epithelioma papillosumcyprini EPC) 上,在EPC上病毒能够增殖; Luedeman等 (1992) 对蓝对虾 (P.stylirostris) 和南美白对虾(Penaeus vannamei Boone) 原代细胞进行培养获得成功。Chen等 (1995) 报道了从三种对虾: 斑节对虾(Penaeus monodon Fabricius)、日本对虾 (P.japonicus Bate) 及长毛对虾 (P.penicillatus Alcoek) 的卵巢、心脏、淋巴组织及外周血细胞中已成功建立了单层细胞培养; 结果还表明培养的Penaeus monodon及Penaeuspenicillatus淋巴组织细胞对MBV敏感,接种病毒并在27~29℃培养2~3d,可见细胞病变产生。最近Tong 等 (1996) 报道了他们成功地建立了中国对虾的单层细胞培养。

生化检验 在对淡水螯虾研究时发现,在对异物识别等免疫反应中,起关键作用的是甲壳动物血细胞的酚氧化酶原系统。在此系统中当酶原被激活后,则可促进血细胞产生抗病毒获其他微生物等的应答反应。蔡完其 (1994) 等在研究感染病毒的中国对虾肝胰脏病理变化时,检测到病虾肝胰脏的酯酶 (esterase,EST)和超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase,SOD) 的活性显著减弱,表明病虾代谢功能与免疫功能明显衰退。由此可见,通过对某些特定生物物质的检测,从一定程度上可了解对虾被病毒感染与否及对其应答情况。

分子生物学方法 Arimoto等 (1995) 将从日本对虾中分离到的BMNV进行了定性,并克隆了部分基因。Lightner实验室对BP和MBV的基因片段进行了克隆及初步的研究。他们通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳确定了多角体外壳蛋白多肽的分子量,经限制性内切酶作用后得到了病毒核酸的部分片段,并进一步将其克隆; 对IHHNV的部分基因进行了克隆,并制备了分子探针,用于这种病毒病害的诊断 (Mari等,1993a,b)。Lu等 (1993) 报道用分离提纯MBV DNA作为聚合酶链式反应 (polymerase chain reaction,PCR) 的模板,通过PCR,扩增获得了一个含有674个碱基的DNA片断,这一片断与昆虫核形多角体 (AcNPV) 有65%的氨基酸序列同原性。以这一片断作为分子探针,可用于MBV的检测。Bruce等 (1994) 用BPDNA片断作为分子探针经原位杂交,在电镜下观察发现BP定位于肝胰腺小管的上皮细胞 (hepatopancreatic tubule epithelium) 和中肠黏膜处。

对虾病毒病的防治

筛选、培养抗病虾品种 郑国兴 (1994) 报道了他关于不同家系的南美白对虾对杆状病毒抗病力研究的结果。LeBlanc等 (1990) 指出褐对虾 (Penaeus aztecus Ives) 对杆状病毒的敏感性不同,而且对虾受病毒感染的状况与年龄有关。MartinezCordova (1992)发现,在经IHHNV感染发病后的对虾中,有些蓝对虾幸存者,这些幸存者不仅存活,而且表现健康,生长良好。因此Martinez认为这些幸存蓝对虾对IHHNV是有抗性的。这些研究提示,可通过不同的筛选、培养方法,选育出抗病虾新品种。

免疫防治 治疗对虾病毒病的药物还在寻找之中。专家们一贯反对滥用药物,他们认为那样会降低亲虾产卵的质量; 而养殖虾则会降低自身的抗病力 (disease resistance),并留下残毒。人们认为,要解决对虾病毒病的关键问题之一就在于提高对虾自身的免疫力。现已发现多糖、生物碱、酮类、有机酸等经口服后能有效地激活免疫系统 (immunological system),增强抗病力 (白立智,1989)。李光友等已成功研制出用于中国对虾病害防治的口服多糖免疫药物 (箫歌,1994; 王雷,1995)。还有些药物如多肽糖 (peptidoglycan,PG)、 奥基索林酸 (oxolinic acid) 等对增强对虾的免疫力有帮助。另外,在养殖对虾的实践中人们还了解到喂蛆蝇 可能有助于提高对虾的免疫力。通过接种疫苗来阻止对虾病毒病的蔓延,将可能是一种有效的方法。已有初 步结果表明,经紫外线减毒的YBV可用来免疫斑节对虾,使其对这种疾病产生免疫力 (刘荭等译, 1994)。

无病毒或无特殊病原体(specific pathogenfree)虾苗的繁育 阻断病毒的纵向传播途径是对虾病毒病 防治中的一个重要举措。因此,在对病毒病进行早期诊断的基础上,选择无病虾作为亲虾,或将虾卵经无毒 处理后培育出无毒虾苗(Lotz 1992),无疑是预防对虾病毒病切实可行的途径。实际上,这一方法在生产中 已被人们广泛采用并取得明显收益。

改善养殖环境 人们在长期的生产实践中已积累了丰富的经验。通过适时清理消毒虾池;合理规定放养 密度;提高饵料质量;改善小生态环境等综合管理的方法,可达到增强对虾的抗病毒能力(徐君卓,1994)。

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